張養(yǎng)東 王加啟 胡 濤 李珊珊 卜登攀 金 迪 孫 鵬 周凌云

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，哈爾濱 150030;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

陰外動(dòng)脈灌注脂多糖對(duì)泌乳奶牛乳的成分和脂肪酸組成的影響

張養(yǎng)東1，2王加啟2*胡 濤2李珊珊2卜登攀2金 迪2孫 鵬2周凌云2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，哈爾濱 150030;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

本試驗(yàn)旨在研究陰外動(dòng)脈灌注脂多糖(LPS)對(duì)泌乳奶牛乳成分、乳脂合成前體物和脂肪酸組成的影響。選用6頭處于泌乳期第(185±30)天、體重(576±36)kg的經(jīng)產(chǎn)的荷斯坦奶牛，隨機(jī)分成2組。采用交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)組陰外動(dòng)脈灌注LPS(Escherichia coliO111∶B4，0.01μg/kg BW)，對(duì)照組灌注生理鹽水。試驗(yàn)分2期，每期試驗(yàn)7 d，2期間隔14 d。結(jié)果表明:泌乳奶牛干物質(zhì)采食量受LPS影響差異不顯著(P＞0.05);LPS顯著提高乳中乳蛋白率(P＜0.05)，對(duì)乳脂率無(wú)顯著影響(P＞0.05);LPS極顯著降低血漿中乳脂合成前體物非酯化脂肪酸的含量(P＜0.01)，β－羥丁酸含量呈先降低后升高的趨勢(shì)(P＞0.05);LPS不同程度地降低了乳脂中飽和脂肪酸(P＞0.05)和短鏈脂肪酸(P＞0.05)的含量，提高了乳脂中不飽和脂肪酸(P＞0.05)和中長(zhǎng)鏈脂肪酸(P＞0.05)的含量，并影響脂肪酸的去飽和作用。結(jié)果提示，LPS是誘發(fā)乳脂合成發(fā)生變化的主要激發(fā)因子之一。

陰外動(dòng)脈;泌乳奶牛;脂多糖;乳成分;乳脂肪酸組成

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌崩解時(shí)釋放的一種主要成分，是誘發(fā)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的主要誘因之一［1－3］，在機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的同時(shí)，機(jī)體脂類代謝也受相應(yīng)的調(diào)控［4－5］。在嚙齒類動(dòng)物上的研究發(fā)現(xiàn)，LPS能調(diào)控乳腺中乳脂肪合成的關(guān)鍵酶，如脂肪酸合成酶和乙酰輔酶羧化酶等［6－7］，下調(diào)脂蛋白脂肪酶的活性［8］，從而抑制乳腺吸收脂肪酸用于乳脂肪的合成［9］。但目前LPS影響乳腺內(nèi)乳脂肪合成的研究?jī)H局限于嚙齒類動(dòng)物，在反芻動(dòng)物上，更多是局限于將LPS作為乳腺內(nèi)乳房炎的激發(fā)因子基礎(chǔ)上的研究。Zebeli等［3］研究表明，隨著泌乳奶牛飼糧中谷物比例的不斷提高，瘤胃中的LPS隨之上升，LPS不但介導(dǎo)了機(jī)體的炎癥反應(yīng)，且與瘤胃中乳脂率呈負(fù)相關(guān)，LPS可能是預(yù)防反芻動(dòng)物乳脂降低綜合癥的一種新的舉措［3］;但LPS在降低乳脂的同時(shí)，對(duì)乳脂脂肪酸組成的影響卻鮮有研究。同時(shí)，LPS在胃腸道中遷移位點(diǎn)研究不盡一致，有研究者認(rèn)為L(zhǎng)PS是從瘤胃遷移到外周血液中［10］，也有研究者認(rèn)為L(zhǎng)PS是從腸道尤其是腸道末端遷移到外周血液中［11－13］。因此，本試驗(yàn)在避開(kāi)反芻動(dòng)物胃腸道的基礎(chǔ)上，直接通過(guò)陰外動(dòng)脈灌注LPS更加直觀的研究LPS對(duì)乳脂脂肪酸組成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)飼糧

選用6頭泌乳期第(185±30)天，體重(576±36)kg的經(jīng)產(chǎn)的荷斯坦奶牛，以玉米、豆粕、麥麩、青貯、苜蓿干草及羊草為主要原料配制基礎(chǔ)飼糧，滿足中國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/t 34—2004)推薦的營(yíng)養(yǎng)需求。飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the diet(DM basis) %

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

1.2.1 灌注液準(zhǔn)備

生理鹽水灌注液:10 m L生理鹽水(無(wú)致熱源的滅菌生理鹽水)。

LPS 灌注液:LPS(Escherichia coliO111∶B4，美國(guó)sigma公司)用生理鹽水配制成0.5 mg/m L儲(chǔ)備溶液，再用生理鹽水按照0.01μg/kg BW 配制成終體積10 m L LPS溶液。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，6頭奶牛隨機(jī)分成2組，每組3頭，試驗(yàn)按時(shí)間順序?yàn)? d預(yù)試期，7 d第1正試期，14 d間隔期，7 d第2正試期。預(yù)試期內(nèi)奶牛接受1次陰外動(dòng)脈生理鹽水灌注，使動(dòng)物機(jī)體適應(yīng)灌注條件，減輕灌注對(duì)動(dòng)物機(jī)體的應(yīng)激。

第1正試期一組奶牛灌注LPS 0.01μg/kg BW(LPS組)，另一組為對(duì)照組，奶牛灌注生理鹽水10 m L;第2正試期，2處理交叉。于正試期第1天07:00灌注。

配制好的溶液經(jīng)預(yù)熱達(dá)到37℃時(shí)，經(jīng)右側(cè)陰外動(dòng)脈一次性灌注，灌注時(shí)要盡量保持試驗(yàn)動(dòng)物安靜，必要時(shí)給試驗(yàn)動(dòng)物套上“防踢棒”，灌注緩慢而均勻進(jìn)行，在5 m in內(nèi)灌注完畢，隨后再用10 m L無(wú)致熱源的滅菌生理鹽水沖洗灌注管道，以保證灌注液全部進(jìn)入試驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)脈血管中。

1.2.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)動(dòng)物采用栓系式飼養(yǎng)，日飼喂2次(07:00和19:00)，自由飲水，擠奶采用利拉伐手推式擠奶機(jī)進(jìn)行。試驗(yàn)期間每天記錄采食量和產(chǎn)奶量，并觀測(cè)試驗(yàn)動(dòng)物的精神狀態(tài)。

1.3 樣品的采集與測(cè)定方法

生鮮乳樣品的采集:于灌注后 0、6、12、24、36、48、60、72、84、96 h 分別采集生鮮乳樣。乳樣分為2份，一份添加防腐劑(bronopol tablet，加拿大D＆F Control System公司)，4℃保存，用于測(cè)定乳成分。另一部分－20℃保存，用于乳脂脂肪酸組成測(cè)定。

血漿樣品的采集:于灌注后 0、6、12、24、72 h分別利用真空采血管(血漿管)采集尾動(dòng)脈血樣，4℃靜置過(guò)夜后，3 000×g、4℃離心15 m in分離血漿。分離后的血漿于－20℃保存。

乳脂肪含量、乳蛋白質(zhì)含量利用Foss-MilkoscanTMMinor乳成分分析儀(Minor Scan FOSS，丹麥)測(cè)定。利用正己烷與異丙醇的混合液提取牛奶上清液中的脂肪，然后對(duì)溶有脂肪的正己烷液體進(jìn)行酸堿甲酯化，再測(cè)定脂肪酸組成，具體方法參見(jiàn) Bu 等［14］文獻(xiàn)。

血漿中非酯化脂肪酸(NEFA)和β－羥丁酸(BHA)的測(cè)定采用 Beckman Synchron CX5PRO分析系統(tǒng)，試劑盒購(gòu)自英國(guó)RANDOX公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以SAS 8.2軟件M IXED模塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)模型中包含試驗(yàn)牛的隨機(jī)因素以及試驗(yàn)期、試驗(yàn)處理、試驗(yàn)時(shí)間和試驗(yàn)處理與試驗(yàn)時(shí)間的交互效應(yīng)等的固定因素。變量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以最小二乘均數(shù)形式列表，顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 陰外動(dòng)脈灌注 LPS對(duì)泌乳奶牛干物質(zhì)采食量和乳成分的影響

由表2可知，泌乳奶牛干物質(zhì)采食量受LPS影響差異不顯著(P＞0.05)。灌注LPS顯著提高乳蛋白率(P＜0.05)，對(duì)乳脂率無(wú)顯著影響(P＞0.05)。

表2 陰外動(dòng)脈灌注脂多糖對(duì)泌乳奶牛乳成分的影響Table 2 Effects of infusion LPS into external pudendal artery on m ilk com position in dairy cow s

2.2 陰外動(dòng)脈灌注LPS對(duì)泌乳奶牛動(dòng)脈血漿中乳脂合成前體物的影響

由表2和圖1可知，與對(duì)照組相比，陰外動(dòng)脈灌注LPS極顯著降低血漿中乳脂合成前體物非酯化脂肪酸的含量(P＜0.01);對(duì)血漿中乳脂合成前體物BHA有增加趨勢(shì)(P＞0.05)，但隨著灌注后時(shí)間的延續(xù)呈先降低后升高的趨勢(shì)(P＞0.05)。

表3 陰外動(dòng)脈灌注脂多糖對(duì)動(dòng)脈血漿中乳脂合成前體物的影響Table 3 Effects of infusion LPS into external pudendal artery on contents of synthesis precursors ofm ilk fat in artery plasma of dairy cows

圖1 陰外動(dòng)脈灌注脂多糖對(duì)泌乳奶牛動(dòng)脈血漿中乳脂合成前體物β－羥丁酸的影響Fig.1 Effects of infusion LPS into external pudendal artery on the content of BHA in artery plasma of dairy cow s

2.3 陰外動(dòng)脈灌注LPS對(duì)泌乳奶牛乳脂肪酸組成的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，陰外動(dòng)脈灌注LPS降低了乳脂中飽和脂肪酸的含量(P＞0.05)，提高了乳脂中單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸和總不飽和脂肪酸的含量(P＞0.05)。陰外動(dòng)脈灌注LPS降低了乳脂短鏈脂肪酸的含量(P＞0.05)，增加了中鏈脂肪酸和長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量(P＞0.05)。

2.4 陰外動(dòng)脈灌注LPS對(duì)泌乳奶牛乳脂去飽和指數(shù)的分析

由表5可知，與對(duì)照組相比，陰外動(dòng)脈灌注LPS 增加了 C16∶1/C16∶0、C18∶1/C18∶0 和c-9，t-11-CLA/t-11-C18∶1(P＞ 0.05)，降低了 C14∶1/C14∶0(P＞0.05)。

表4 陰外動(dòng)脈灌注脂多糖對(duì)泌乳奶牛乳脂肪酸組成的影響Table 4 Effects of infusion LPS into external pudendal artery on m ilk fat constituents in dairy cows

3 討論

3.1 陰外動(dòng)脈灌注LPS對(duì)泌乳奶牛乳成分的影響

研究發(fā)現(xiàn)，谷物誘導(dǎo)的泌乳奶牛亞急性瘤胃酸中毒隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延續(xù)，外周血漿中LPS含量隨之升高，12 h后達(dá)到每毫升0.81內(nèi)毒素單位(endotoxin unit)［12］;乳汁中乳脂率受到顯著抑制(P＜0.01)，但有增加乳蛋白率的趨勢(shì)(P=0.08)［15］。本試驗(yàn)結(jié)果與之相似，雖然本試驗(yàn)陰外動(dòng)脈灌注的LPS劑量與Khafipour等［12］報(bào)道的血液中LPS含量相近，但本試驗(yàn)在抑制乳脂合成上未達(dá)到顯著差異(P＞0.05)，極顯著提高了乳汁中的乳蛋白率(P＜0.01)。這可能與試驗(yàn)動(dòng)物的泌乳階段有關(guān)，Khafipour等［12］選用的試驗(yàn)動(dòng)物為泌乳盛期奶牛［第(84±29)天］，而本試驗(yàn)選用的試驗(yàn)動(dòng)物為泌乳中后期的奶牛［第(185±30)天］。

表5 陰外動(dòng)脈灌注脂多糖對(duì)泌乳奶牛去飽和指數(shù)分析Table 5 Effects of infusion LPS into external pudendal artery on the de-saturated indices in dairy cows

3.2 陰外動(dòng)脈灌注LPS對(duì)泌乳奶牛乳脂合成前體物的影響

乳汁C4～C15、50%的C16脂肪酸是乳腺內(nèi)源合成的脂肪酸，乳汁中50%的C16和C16以上的脂肪酸是乳腺直接從血漿中攝取轉(zhuǎn)運(yùn)［16］。內(nèi)源合成的脂肪酸的前體物為瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的BHA和乙酸，乳腺攝取的脂肪酸來(lái)源于血漿中NEFA和富含三酰甘油的脂蛋白［17］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，陰外動(dòng)脈灌注LPS顯著降低了泌乳奶牛動(dòng)脈血漿中NEFA濃度(P＜0.05)，這與乳汁中乳脂率的降低相吻合;血漿中的BHA濃度(P＞0.05)雖然有所增加，但隨著灌注時(shí)間的延續(xù)，呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，這與Waldron等［18］報(bào)道結(jié)果相同，Waldron等［18］研究發(fā)現(xiàn)，泌乳初期奶牛乳腺內(nèi)注射LPS時(shí)，血漿中NEFA濃度和BHA濃度極顯著降低(P＜0.01)，血漿中BHA濃度在注射后9 h達(dá)到最低［18］;本試驗(yàn)血漿中BHA濃度在灌注后6 h達(dá)到最低，這可能與采樣時(shí)間點(diǎn)不同有關(guān)。但Myers等［19］和 Husier等［20］分別在豬、犢牛上試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS未能顯著影響血液中NEFA的濃度(P＞0.05)。這可能與試驗(yàn)動(dòng)物的區(qū)別有關(guān)，本試驗(yàn)選擇試驗(yàn)動(dòng)物為泌乳奶牛，血漿中NEFA除用于生理活動(dòng)外，還用于乳的生產(chǎn)，而Myers等［19］和Husier等［20］選擇的試驗(yàn)動(dòng)物豬、犢牛血漿中NEFA主要用于生理活動(dòng)。

3.3 陰外動(dòng)脈灌注LPS對(duì)泌乳奶牛乳脂肪酸組成的影響

研究發(fā)現(xiàn)，高精料飼糧條件下瘤胃液pH降低，革蘭氏陰性菌溶解，釋放大量的LPS［11－12，21－23］，可能降低了脂類水解［24－25］，加快食糜外流速度，縮短微生物對(duì)不飽和脂肪酸的作用時(shí)間，因此降低了生物氫化效率［26］，增加了乳中不飽和脂肪酸的含量［24，27］。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)LPS影響乳脂脂肪酸的組成，增加了乳脂中不飽和脂肪酸的含量。雖然以前的研究重點(diǎn)在飼糧經(jīng)瘤胃、肝臟、乳腺直到乳汁等一系列過(guò)程中發(fā)生的變化，LPS是否是主要的增加乳中不飽和脂肪酸的因子有待研究，本試驗(yàn)越過(guò)瘤胃、肝臟等復(fù)雜的器官，直接從供給乳腺供血的陰外動(dòng)脈灌注LPS研究其對(duì)乳脂中乳脂肪酸的影響，結(jié)果證實(shí)了LPS是引起乳脂中不飽和脂肪酸提高的主要誘因之一。

3.4 陰外動(dòng)脈灌注LPS對(duì)泌乳奶牛乳脂中去飽和指數(shù)的分析

不飽和脂肪酸的去飽和作用需要△去飽和酶系的參與［28］，而乳腺中△9去飽和酶活性可用C14∶1/C14∶0、C16∶1/C16∶0、C18∶1/C18∶0 和c-9，t-11-CLA/t-11-C18∶1 等間接反映［29］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，陰外動(dòng)脈灌注LPS組提高了 C16∶1/C16∶0、C18∶1/C18∶0 和c-9，t-11-CLA/t-11-C18∶1，這與乳脂脂肪酸中不飽和脂肪酸的含量提高相吻合;但C14∶1/C14∶0卻有降低的趨勢(shì)，這可能是C14∶1是短鏈脂肪酸，血漿中合成前體物供給不足所致，具體原因待進(jìn)一步研究確證。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，LPS影響乳汁中乳成分組成、乳脂合成前體物的生成以及乳脂肪酸的含量與比例，是誘發(fā)乳脂合成發(fā)生變化的主要激發(fā)因子之一。

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*Corresponding author，professor，E-mail:wang-jia-qi@263.net

(編輯 王智航)

Infusion of Lipopolysaccharide into External Pudendal Artery of Lactating Dairy Cows:Effects on Milk Composition and Milk Fat Constituents

ZHANG Yangdong1，2WANG Jiaqi2*HU Tao2LIShanshan2BU Dengpan2JIN Di2SUN Peng2ZHOU Lingyun2
(1.Institute of Animal Science，Northeast Agricultural University，Harbin150030，China;2.Institute of Animal Science of the Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，China)

The study was designed to evaluate m ilk composition，content of synthesis precursors and m ilk fat constituents in response to the infusion of lipopolysaccharide(LPS)into external pudendal artery of lactating dairy cows.Six multiparous Holstein cows［(185±30)days of lactation，BW=(576±36)kg］were random ly divided into two group.A crossover trial design was used in the study，and cows in experimental group and control group were infused LPS(Escherichia coliO111∶B4，0.01 μg/kg BW)and physiological saline into external pudendal artery，respectively.The study consisted of 2 experimental periodswith 7 d each and a 14-day-interm ission between.The results showed as follows:dry matter intake(DM I)was not significantly affected by LPS challenge(P＞0.01);m ilk protein percentage was significantly increased(P＞0.05)，but m ilk fat percentage was not significantly affected by LPS challenge(P＞0.05);LPS challenge also significantly reduced the plasma non-esterified fatty acid(NEFA)content(P＜0.01)，which was the synthesis precursor ofm ilk fat，meanwhile，the hydroxybutyric acid(BHA)content tended to decrease at first and then increase(P＞0.05);by the challenge of LPS，the contents of saturated fatty acids(P＞0.05)and short-chain fatty acids(P＞ 0.05)were decreased，but the ones of unsaturated fatty acids and m iddle-chain fatty acids were increased(P＞0.05)，in addition，the desaturation of fatty acidswas also affected.It can be concluded that LPS is one of the major factors in affecting m ilk fat synthesis.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(8):1317-1323］

external pudendal artery;lactating dairy cow;lipopolysaccharide;m ilk composition;m ilk fat constituents

S823

A

1006-267X(2011)08-1317-07

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.08.010

2011－03－08

張養(yǎng)東(1982—)，男，山東濟(jì)寧人，博士研究生，從事反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與牛奶質(zhì)量研究。E-mail:zyd1982@yahoo.cn

*通訊作者:王加啟，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail:wang-jia-qi@263.net