吳學(xué)芳，何正波，陶紅梅，蔡志華

(1.重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400047； 2.重慶師范大學(xué)資源昆蟲(chóng)和分子生物研究所,重慶 400047)

近年來(lái)，我國(guó)蝗蟲(chóng)災(zāi)害頻繁爆發(fā),嚴(yán)重影響了天然草地植被的正常生長(zhǎng)發(fā)育[1]，蝗蟲(chóng)危害面積占草原蟲(chóng)害危害面積的52.4%[2]。直翅目昆蟲(chóng)東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)是一種洲際性農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，也是引發(fā)我國(guó)蝗災(zāi)的最主要害蟲(chóng)。目前，蝗總科的染色體已有不少的研究，但東亞飛蝗的染色體研究尚少。對(duì)東亞飛蝗染色體的研究將為生物治蝗奠定基礎(chǔ)[3]?；认x(chóng)染色體的研究普遍采用壓片染色顯帶，進(jìn)行C帶和銀染核仁組織區(qū)(Ag-nucleolus organizer region,Ag-NOR)定位研究。本試驗(yàn)采用哺乳動(dòng)物常用的懸浮滴片法，研究了東亞飛蝗C帶和銀染顯帶，并對(duì)其帶型進(jìn)行分析。

1 材料與方法

本研究所用東亞飛蝗由重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院資源昆蟲(chóng)分子生物研究所提供。

1.1染色體標(biāo)本制備 根據(jù)陶紅梅等[4]滴片法略做修改。東亞飛蝗活體注射0.04%秋水仙素溶液0.3 μL，8 h后活體解剖取出精巢。于0.75%的生理鹽水中剔凈脂肪和筋膜后，放入37℃預(yù)溫的1%檸檬酸鈉溶液中低滲30 min[5]。轉(zhuǎn)至新鮮配制的3∶1甲醇冰醋酸固定液中30 min，換固定液重復(fù)固定數(shù)次，直至精巢發(fā)白，取出剪碎，新鮮固定液懸浮固定，1 000 r/min離心，棄上清液，反復(fù)4次，滴片。

1.2C帶 C帶處理采用BSG法，具體過(guò)程參照Summer[6]方法稍加修改，玻片65℃烘箱內(nèi)老化24 h，0.2 mol/L鹽酸溶液室溫處理1 h，60℃氫氧化鋇110 s，2×SSC在60℃恒溫水浴鍋內(nèi)處理60 min。10%Gimesa染色8 min，鏡檢。

1.3銀染 按Howell和Black[7]的方法，略做改進(jìn)。玻片于65℃水浴，加50%硝酸銀溶液4滴， 2%明膠顯影液2滴，覆以蓋片，直至玻片標(biāo)本呈茶褐色(一般為3 min)。蒸餾水沖洗，10% Gimesa復(fù)染8 min，鏡檢。

1.4染色體核型 取30只蝗蟲(chóng)按照上述方法制得染色體玻片標(biāo)本，每個(gè)個(gè)體選取10個(gè)分散較好的分裂中期細(xì)胞顯微照相，沖洗放大。用Image-Pro Plus 5.1軟件測(cè)量照片上染色體和C帶帶紋長(zhǎng)度等相關(guān)數(shù)據(jù)，并對(duì)染色體進(jìn)行分組、編號(hào)，分析核型、C帶和銀染帶型，計(jì)算染色體的相對(duì)長(zhǎng)度和異染色質(zhì)含量[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1核型 東亞飛蝗的染色體數(shù)目為2N(♂)=23。性別決定機(jī)制為XO。染色體組式為4L+4M+3S+XO，包括大型染色體4對(duì)，相對(duì)長(zhǎng)度RL值13.99～11.11；中型染色體4對(duì)，相對(duì)長(zhǎng)度RL值8.16～5.16；小型染色體3對(duì)，相對(duì)長(zhǎng)度RL值3.22～2.44；X染色體為大型染色體，RL值17.37，染色體長(zhǎng)度在整個(gè)染色體組中位居第一(表1)。本試驗(yàn)顯示的染色體核型和組式與賈瀟凌和馬恩波[9]、馬恩波和歐曉紅[10]的研究結(jié)果一致，可確定此為東亞飛蝗的基本核型。

表1 東亞飛蝗染色體和C帶數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2C帶 東亞飛蝗所有染色體具有明顯的端著絲粒帶，與已進(jìn)行染色體研究的大多數(shù)蝗總科種類一致。早前期細(xì)胞著絲粒深染點(diǎn)附著在細(xì)胞核膜上，減數(shù)分裂Ⅰ和減數(shù)分裂Ⅱ中期染色體都具有著絲粒C帶。其中，第1、4、7對(duì)和X染色體著絲粒較淺，僅隱約可見(jiàn)；第2、3、5、6、9、10、11對(duì)染色體著絲粒呈現(xiàn)大小不同的深染區(qū)；第8對(duì)染色體著絲粒為中度著色，第2對(duì)染色體端粒深染；未見(jiàn)居間帶(圖1)。染色體組中異染色質(zhì)總含量為(15.88±0.71)%。

2.3銀染 間期細(xì)胞銀染深染點(diǎn)為3～6個(gè)不等，多為5個(gè)，有的深染點(diǎn)緊貼于細(xì)胞核膜上。減數(shù)分裂Ⅰ前期觀察到黑色團(tuán)塊Ag-NOR，多為3個(gè)。減數(shù)分裂Ⅰ中期，觀察到2號(hào)染色體近端部次縊痕處呈較規(guī)則圓形Ag-NOR，較為恒定。極少數(shù)細(xì)胞除2號(hào)染色體的深染點(diǎn)外，1號(hào)染色體近著絲粒初縊痕處有形狀不規(guī)則Ag-NOR。 其他各期未發(fā)現(xiàn)明顯的Ag-NOR(圖2)。

圖1 東亞飛蝗中期染色體C帶及排序

圖2 東亞飛蝗中期銀染及排序

3 討論與結(jié)論

以往蝗蟲(chóng)染色體研究多采用冰凍揭片法或壓片法，本試驗(yàn)采用改進(jìn)后的懸浮滴片法[4]，玻片較其他方法更為干凈，染色體形態(tài)良好，細(xì)胞質(zhì)抽提干凈，利于觀察和顯帶研究。

制片過(guò)程中，秋水仙素的注射量和低滲時(shí)間是影響東亞飛蝗染色體標(biāo)本形態(tài)主要因素。秋水仙素注射量過(guò)大，染色體凝縮，甚至可呈點(diǎn)狀；注射量過(guò)小，則無(wú)法起到阻斷細(xì)胞分裂的作用，中期細(xì)胞少。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，每只蟲(chóng)體注射3 μL 0.04%秋水仙素，處理8 h，效果最好。低滲時(shí)間也會(huì)影響染色體形態(tài)。低滲時(shí)間過(guò)短，染色體伸展不好，呈緊縮狀；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，染色體疏松，崩解，甚至出現(xiàn)燈刷染色狀外觀，若繼續(xù)低滲會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破裂，染色體丟失。1%檸檬酸鈉溶液低滲30 min可達(dá)到較好的效果。

3.1C帶 近年來(lái)，人們利用分子生物學(xué)研究手段證實(shí)C帶主要是AT與GC高度重復(fù)序列[11]。C帶標(biāo)本中深染部分即為結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)部分，著色深淺程度與異染色質(zhì)含量高低有直接聯(lián)系，可因此進(jìn)行種間的比較。根據(jù)Webb[12]的觀點(diǎn)，深黑色為結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)密集區(qū)域，灰黑色帶則為結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)與常染色體夾雜的區(qū)域。第2對(duì)染色體端粒處出現(xiàn)深染,說(shuō)明較其他染色體，該染色體端粒處結(jié)構(gòu)緊密且非組蛋白含量也更為豐富。東亞飛蝗均為端部著絲粒染色體，且某些染色體出現(xiàn)了端帶，而以往研究的大多數(shù)蝗總科[9,12-15]的種類也出現(xiàn)了此特點(diǎn)。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，東亞飛蝗與其他種類C帶差異表現(xiàn)在端帶、居間帶的有無(wú),個(gè)別染色體上端帶的大小、著色強(qiáng)弱，結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)含量多少等方面。

從遺傳學(xué)角度來(lái)看，C帶所顯示的結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)區(qū)域在遺傳上轉(zhuǎn)錄活性低，在種內(nèi)水平上具有一定穩(wěn)定性，低級(jí)階元分類上是一個(gè)有用的指標(biāo)[11,16]。但與銀染帶型相比，C 帶的進(jìn)化速率較快，往往在相近種間C 帶異染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)及組成都具有差異[13]。就異染色質(zhì)含量來(lái)看，進(jìn)行C帶研究的蝗蟲(chóng)異染色質(zhì)含量普遍在20%左右[8,11,13-17]。而姚世鴻[13]研究的同科的疣蝗(Trilophidiaannulata)異染色質(zhì)含量為21.15%，韋仕珍和鄧維安[17]研究的隆叉小車蝗(Oedaleusabruptus)和紅脛小車蝗(O.manjius)異染色質(zhì)含量分別為22.36%和22.07%，相比之下，東亞飛蝗的含量較低，僅為15.88%，與傅鵬和鄭哲民[8]研究的癩蝗科友誼華癩蝗(Sinotmethisamicus)含量(15.18%)較為接近。說(shuō)明異染色質(zhì)含量在同科不同種間含量存在較大差異。一般情況下，C帶處理的結(jié)果往往只能顯示一個(gè)物種或種群結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)主要的分布和含量特征[18]。而賈瀟凌和馬恩波[9]的東亞飛蝗C帶結(jié)果顯示其異染色質(zhì)含量為18.87%，未見(jiàn)端帶。根據(jù)Max和Bernard[19]報(bào)道，同物種的C帶帶型會(huì)隨著如酸堿處理時(shí)間不同和染色體伸展程度等因素的影響而變化。因此，只有在同一細(xì)胞分裂時(shí)期并在基本相同的分帶處理?xiàng)l件下才可能得出較為一致的結(jié)果。

3.2銀染核仁組織區(qū) 銀染是中期染色體的核仁組織區(qū)(NOR)，Howell[20]和Hsu等[21]的研究顯示，深染區(qū)域是具有轉(zhuǎn)錄活性的18S+28S rDNA。因此理論上深染點(diǎn)應(yīng)該為偶數(shù)，但是本試驗(yàn)卻觀察到深染點(diǎn)大多呈奇數(shù)，且僅在同源染色體的其中1條上出現(xiàn)，陳曉光和何麟[22]在研究褐斑大蠊(Periplanetabrunnea)時(shí)也出現(xiàn)此現(xiàn)象?？赏茰y(cè)東亞飛蝗只有一條18S+28S rDNA基因功能上有活性。間期及早前期深染點(diǎn)多，到減數(shù)分裂Ⅰ中期，只可見(jiàn)1處或2處深染點(diǎn)，可見(jiàn)，rDNA轉(zhuǎn)錄活性降低。減數(shù)分裂Ⅰ后期、末期以及減數(shù)分裂Ⅱ未見(jiàn)深染。2處深染的情況并不多見(jiàn)，另一處出現(xiàn)在1號(hào)染色體近著絲粒端的深染可能僅是2號(hào)染色體rDNA未充分表達(dá)時(shí)，作為補(bǔ)償性的開(kāi)放。此種核仁組織區(qū)的多態(tài)性，在以往研究的多種動(dòng)物中也有發(fā)現(xiàn)，如靈長(zhǎng)類[23]、兩棲類[24]、魚(yú)類[25]等。18S+28S rDNA轉(zhuǎn)錄酸性蛋白，而酸性蛋白又與染料中銀離子特異性結(jié)合而著色[26]。

與C帶、G帶所不同的是，核仁組織區(qū)的定位以及其活性，具有較慢的進(jìn)化速率和相對(duì)較大的保守性，一般較為恒定。正是由于核仁組織區(qū)定位在遺傳學(xué)上的這種特點(diǎn)，使得該項(xiàng)技術(shù)成為揭示一個(gè)大分類單元(高級(jí)階元)中種系發(fā)生關(guān)系的一個(gè)有用指標(biāo)[27]。 本研究的結(jié)果顯示，東亞飛蝗的核仁組織區(qū)定位于2號(hào)染色體端部次縊痕處(圖2)，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其具有恒定特點(diǎn)。而賈瀟凌和馬恩波[9]研究的東亞飛蝗銀染定位在M8上，產(chǎn)生差異的原因尚不明白，需做進(jìn)一步研究。

馬恩波和郭亞平[14]在研究斑腿蝗科發(fā)現(xiàn)銀染核仁組織區(qū)與C帶有相關(guān)性，出現(xiàn)Ag深染區(qū)域也有C帶帶紋，而在稻蝗屬、卵翅蝗屬、偽稻蝗屬[28]中也發(fā)現(xiàn)此對(duì)應(yīng)關(guān)系。但是本試驗(yàn)的結(jié)果卻未顯示出這種關(guān)聯(lián)，東亞飛蝗的核仁組織區(qū)位于2號(hào)染色體靠近端粒區(qū)域，C帶在次縊痕區(qū)域未有帶型，僅出現(xiàn)端粒深染的情況。在有關(guān)飛蝗屬的文獻(xiàn)中也未發(fā)現(xiàn)有此種聯(lián)系，這種聯(lián)系并不存在于飛蝗屬中。

東亞飛蝗核仁組織區(qū)定位于2號(hào)染色體，且2號(hào)染色體的C帶帶型豐富，因此可作為東亞飛蝗的遺傳標(biāo)記。

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