呂敬媛,王 丹,趙玉楠

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,黑龍江佳木斯 154003)

妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorders in pregnancy)是妊娠期特有的疾病。該病嚴(yán)重影響母嬰健康,是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒病率和病死率的主要原因。至今病因未明[1]。從免疫學(xué)觀點(diǎn)看,妊娠被認(rèn)為是成功的自然同種異體移植,正常妊娠的維持有賴于胎兒母體間免疫平衡的建立和穩(wěn)定,如這種平衡被打破,即可導(dǎo)致發(fā)生免疫排斥反應(yīng),從而引起一系列的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,進(jìn)而發(fā)生妊娠期高血壓疾病[2～4]。PD-1作為新近發(fā)現(xiàn)的 CD28家族重要成員,已被證實(shí)通過(guò)抑制T細(xì)胞的活化和增殖來(lái)負(fù)調(diào)控免疫應(yīng)答[5],并且在調(diào)節(jié)免疫耐受以及腫瘤免疫逃逸等中發(fā)揮重要作用。因此,本研究用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定妊娠期高血壓疾病患者外周血和雙陽(yáng)性細(xì)胞比例,探討PD-1在妊娠期高血壓疾病發(fā)病中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有對(duì)象均選取2009—07～2010—06在我院婦產(chǎn)科就診及住院的妊娠婦女。其中妊娠期高血壓疾病患者37例,平均年齡(26.4±4.2)歲,平均孕齡(35.3±4.1)周。包括重度子癇前期患者10例,輕度子癇前期患者12例,妊娠期高血壓患者15例,正常妊娠組15例,平均年齡(25.2±3.7)歲,平均孕齡(36.5±4.6)周。各組病例年齡及孕齡比較均無(wú)顯著性差異。診斷及分類標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)樂(lè)杰主編《婦產(chǎn)科學(xué)》第7版[1]。孕婦均為初孕婦單胎妊娠,既往無(wú)原發(fā)性高血壓、糖尿病史,無(wú)反復(fù)流產(chǎn)史,心肝肺腎功能正常,未經(jīng)生殖技術(shù)幫助,無(wú)免疫性疾病,未經(jīng)免疫藥物治療。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

流式細(xì)胞檢測(cè)所用單抗及同型對(duì)照抗體:PE-cy5標(biāo)記人CD4單抗,FITC標(biāo)記人PD-l單抗;PE-cy5標(biāo)記人和FITC標(biāo)記人IgGI同型對(duì)照抗體,均購(gòu)自EB公司。

1.3 方法

1.3.1 血標(biāo)本采集及外周血PBMC分離

分別抽取各組研究對(duì)象前臂肘靜脈血3mL(妊娠期高血壓疾病患者均于住院治療前抽血),采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。將制成的單個(gè)核細(xì)胞懸液在12h內(nèi)送流式檢驗(yàn)和雙陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

取單個(gè)核細(xì)胞懸液,將其分成4份,每份150μ L,加流式單抗或同型對(duì)照抗體:(l)空白管:加20μ L PBS;(2)同型對(duì)照1:加10μ L PE-Cy5標(biāo)記人CD4單抗和10μ L FITC 標(biāo)記人同型對(duì)照抗體;(3)同型對(duì)照2:加 10μ L PE-Cy5標(biāo)記人同型對(duì)照抗體和 10μ L FITC標(biāo)記人 PD-1單抗;(4)測(cè)定管:加PE-Cy5標(biāo)記人CD4單抗以及FITC標(biāo)記人PD-1單抗。4℃孵育30min,加1mL PBS1000r/min離心8min洗滌,共洗滌二次;加200μ L PBS重懸細(xì)胞,上機(jī)檢測(cè)。以各自的同型對(duì)照管參數(shù)設(shè)門,將測(cè)定管參數(shù)減去同型對(duì)照背景,則為測(cè)定管參數(shù)值。以相關(guān)配套軟件計(jì)算和+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例,結(jié)果以百分比(%)表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,以SPSS13.0軟件中的單因素方差分析(One-Way ANOVA),各組兩兩比較用q檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1 各組PBMC中CD4+和CD4+PD-1+細(xì)胞比例(±s)

表1 各組PBMC中CD4+和CD4+PD-1+細(xì)胞比例(±s)

★與正常妊娠組相比(P＜0.05),▲ 與妊娠期高血壓組相比(P＜0.05),● 與輕度子癇前期組相比(P＜0.05)。

組 別 n CD+4(%) CD+4PD-1+(%)正常妊娠組 15 21.87±1.23 3.89±0.73妊娠期高血壓組 15 21.90±1.20 9.50±1.02★輕度子癇前期組 12 22.80±0.91★▲ 17.90±2.13★▲重度子癇前期組 10 25.27±0.99★▲● 25.60±3.02★▲●

3 討論

從現(xiàn)代免疫學(xué)觀點(diǎn)看,妊娠是母胎免疫系統(tǒng)相互作用的過(guò)程,胎兒攜帶有父源性抗原,對(duì)母體的免疫系統(tǒng)來(lái)說(shuō)是一種半同種移植物,正常妊娠是母體免疫系統(tǒng)對(duì)胎兒的免疫耐受過(guò)程。一旦母胎間免疫耐受平衡失調(diào),便可導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng),從而發(fā)生妊娠失敗及某些妊娠并發(fā)癥,如妊娠期高血壓疾病、習(xí)慣性流產(chǎn)等。目前大量的研究表明妊娠期高血壓疾病與免疫系統(tǒng)存在密切的關(guān)系。在妊娠期高血壓疾病形成過(guò)程中,免疫系統(tǒng)和免疫細(xì)胞起到了重要作用。在妊娠期高血壓疾病形成和演變中不同的T淋巴細(xì)胞亞群起不同的作用,其中對(duì)其發(fā)生起優(yōu)勢(shì)作用的T細(xì)胞類型是CD4陽(yáng)性T輔助細(xì)胞(Th)。PD-1是表達(dá)在激活狀態(tài)的 T、B細(xì)胞上的一種協(xié)同性信號(hào)調(diào)節(jié)分子,屬于免疫球蛋白(Ig)超家族成員,與以前發(fā)現(xiàn)的CTLA-4有相似性,屬于負(fù)性調(diào)控的協(xié)同信號(hào)分子,表現(xiàn)對(duì)激活后T、B細(xì)胞炎癥程度的下調(diào)和炎癥范圍的限制[6]。與CT LA-4表達(dá)時(shí)限的區(qū)別是PD-1表達(dá)的時(shí)限相對(duì)較晚,持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)PD-1多表達(dá)在慢性感染性疾病或者自身免疫性疾病的炎性細(xì)胞表面,其配體主要有PD-Ll和PD-L2,PD-1與其配體結(jié)合后介導(dǎo)對(duì)免疫細(xì)胞周圍性耐受,能下調(diào)其炎癥反應(yīng)程度。缺乏PD-1受體的T淋巴細(xì)胞(無(wú)論是還是細(xì)胞)的增殖能力和分泌細(xì)胞因子功能均顯著增強(qiáng),并且基本不表現(xiàn)凋亡,不能介導(dǎo)周圍性耐受[7]。PD-1在妊娠期高血壓疾病病人外周血PBMC中的表達(dá)情況,目前尚無(wú)明確結(jié)果。本研究用流式細(xì)胞方法測(cè)定了妊娠期高血壓疾病患者外周血PBMC中CD4和PD-1的表達(dá)水平,并與正常妊娠組進(jìn)行了對(duì)比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),妊娠期高血壓疾病患者細(xì)胞比例增多,重度子癇前期組患者其比例增加更明顯,與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。與其他報(bào)道不同的是,本研究檢測(cè)了不同類型的妊娠期高血壓疾病患者外周血細(xì)胞上PD-l表達(dá)的水平,即 PBMC中比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常妊娠組比較,在妊娠期高血壓疾病各組雙陽(yáng)性細(xì)胞比例均較對(duì)照組增高,由文獻(xiàn)可知PD-l是在T細(xì)胞激活以后表達(dá)的負(fù)性調(diào)控表面分子,故結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè)細(xì)胞高表達(dá)PD-1其作用可能是反饋性抑制細(xì)胞的過(guò)度激活。這對(duì)深入研究妊娠期高血壓疾病的機(jī)制展現(xiàn)了一個(gè)窗口,對(duì)臨床治療提供了一個(gè)潛在的靶標(biāo)。但是PD-1對(duì)妊娠期高血壓疾病影響的直接證據(jù)還有賴于進(jìn)一步的研究。

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