梁 帆 程玉謙 張 娜 王 俊 王淑香 郭文學(xué) 祁 偉

志賀菌是細菌性痢疾（菌?。┑牟≡w，是影響全球公共衛(wèi)生的重要問題。上世紀70年代以來，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，耐藥菌及多重耐藥志賀菌逐漸增多。本研究對天津地區(qū)2009—2010年分離出的志賀菌臨床株進行耐藥性分析，并對氟喹諾酮耐藥菌株的耐藥機制進行深入研究。

1 材料與方法

1.1 菌株及來源 收集分離自天津地區(qū)多家三級甲等醫(yī)院2009—2010年腸道門診患者糞便標本的志賀菌119株。經(jīng)常規(guī)生化及血清凝集試驗證實，包括福氏志賀菌19株，宋內(nèi)氏志賀菌 99株，鮑氏志賀菌 1株。qnrA、qnrB、qnrS、aac（6′）-ib-cr陽性菌株為本研究所保存，質(zhì)粒接合試驗所用受體菌大腸埃希菌J53 AZR由上海復(fù)旦大學(xué)王明貴教授惠贈。

1.2 培養(yǎng)基及藥敏紙片 水解酪蛋白（MH）瓊脂購自上海伊華生物科技有限公司。藥敏紙片包括慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲口惡 唑（SMZco）、阿米卡星、痢特靈（呋喃唑酮）、氨芐西林、頭孢哌酮舒巴坦、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、亞胺培南、萘啶酸、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星及左氧氟沙星共17種，購自北京天壇生物制品研究所。引物合成及PCR產(chǎn)物測序由北京六合華大基因技術(shù)有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 抗菌藥物敏感試驗 所有菌株嚴格按照CLSI2010標準，采用改良Kirby-Bauer紙片擴散法進行檢測。并對qnr、aac（6′）-ib-cr及qepA陽性供體菌、受體菌、接合菌采用微量肉糖稀釋法測定抗生素最低抑菌濃度（MIC）,質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.3.2 細菌總DNA的提取 采用煮沸法提取細菌總DNA作為PCR反應(yīng)的擴增模板[1]。

1.3.3 氟喹諾酮耐藥菌gyrA、parC基因突變的檢測 引物gyrAF/gyrAR[2]、parCF/parCR[3]分別擴增gyrA、parC 基因片段，見表1。反應(yīng)體系為25 μL，取PCR反應(yīng)產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠系統(tǒng)下觀察結(jié)果。對PCR反應(yīng)產(chǎn)物測序，結(jié)果經(jīng)blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫公布的標準菌序列進行比對，分析gyrA、parC基因突變位點及數(shù)目與氟喹諾酮耐藥性的關(guān)系。

表1 PCR擴增反應(yīng)引物序列及特征

1.3.4 qnrA、qnrB、qnrS、aac（6′）-ib-cr和qepA的基因檢測及序列分析 所有菌株采用PCR擴增qnrA、qnrB、qnrS、aac（6）′-ib-cr和qepA基因片段，反應(yīng)引物設(shè)計參考文獻[4-5]，見表1。對PCR反應(yīng)產(chǎn)物測序，結(jié)果經(jīng)blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫公布的標準菌序列進行比對，進一步確定基因型。

1.3.5 質(zhì)粒接合試驗 以喹諾酮耐藥基因（PMQR）陽性菌為接合試驗供體菌，參照Wang等[6]的方法，以耐疊氮化鈉的大腸埃希菌E.coli J53（Azide resistant）為受體菌，采用濾膜結(jié)合法進行接合試驗。取對數(shù)生長期的供體菌1.0 mL及受體菌0.5 mL菌液在1.5 mL的Eppendorf管中離心，重新懸浮后轉(zhuǎn)種到預(yù)熱好的LB瓊脂平板濾膜上，35℃孵育4~6 h，接合子以含復(fù)方磺胺甲口惡 唑（300 mg/L）和疊氮化鈉（100 mg/L）的LB瓊脂平皿上篩選，置于35℃孵育18~24 h，微量肉湯稀釋法測定供體菌、受體菌、接合菌的MIC值。

1.3.6 質(zhì)粒抽提 參照文獻[7]方法，提取供體菌、受體菌、接合菌質(zhì)粒DNA。對接合菌的質(zhì)粒DNA進行相對應(yīng)耐藥基因的PCR擴增，產(chǎn)物進行序列測定。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗結(jié)果 見表2、3。志賀菌對一代喹諾酮萘啶酸敏感率最低，其次是氨芐西林、復(fù)方磺胺甲口惡唑和四環(huán)素，3種及3種以上抗生素多重耐藥菌株接近98%。對三代頭孢菌素藥物敏感率高，未發(fā)現(xiàn)亞胺培南及頭孢哌酮舒巴坦耐藥株。對氟喹諾酮類藥物耐藥率低于5%，左氧氟沙星耐藥率低于2%。5株氟喹諾酮耐藥菌均為福氏志賀菌，宋內(nèi)氏志賀菌對萘啶酸耐藥率高，未出現(xiàn)氟喹諾酮耐藥菌。

表3 5株氟喹諾酮耐藥福氏志賀菌藥敏結(jié)果[抑菌環(huán)直徑（mm），耐藥性]

2.2 gyrA、parC基因擴增結(jié)果及序列分析 5株耐氟喹諾酮志賀菌全部擴增出gyrA和parC片段，片段長度分別為648、469 bp，瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)均一條帶，且與目的片段大小相等，見圖1。對PCR產(chǎn)物進行測序，與GenBank標準菌株Blast比對，4株同時存在gyrA83、87位點及parC80位點突變，1株缺乏gyrA87位點突變，見表4。另有菌株3171 gyrA 176位點GTA（His）?GGA（Pro）突變，但位于QRDR區(qū)外。

圖1 部分氟喹諾酮耐藥志賀菌gyrA、parC基因擴增電泳圖

表4 5株氟喹諾酮耐藥志賀菌基因突變

2.3 qnrA、qnrB、qnrS、aac（6′）-ib-cr和qepA基因擴增結(jié)果及序列分析 119株志賀菌3株攜帶qnr基因和（或）aac（6′）-ib-cr基因，其中1株攜帶qnrS1基因；2株攜帶aac（6′）-ib-cr基因。未檢測出qnrA、qn?rB、qepA基因。5株經(jīng)PCR檢測出現(xiàn)560 bp的預(yù)期條帶，經(jīng)測序有2株存在304位（T→C）、535位（G→T）位點突變，確定為aac（6′）-ib-cr基因陽性株。PCR擴增qnrS、aac（6′）-ib-cr基因電泳圖，見圖2。

2.4 PMQR基因陽性菌株質(zhì)粒接合試驗 3株P(guān)MQR陽性菌株中N8、F8質(zhì)粒結(jié)合試驗接合轉(zhuǎn)移成功，J53接合前后受體菌及接合子的藥敏結(jié)果變化，見表5。堿裂解法提取供體菌、受體菌、接合子質(zhì)粒DNA，純化并進行對應(yīng)PMQR基因PCR擴增，均可擴增出目標片段，見圖2，測序與供體菌攜帶的PMQR基因序列完全一致。

表5 大腸埃希菌J53 AZR與N8、F8質(zhì)粒接合前后的MIC值變化

圖2 PMQR基因陽性菌株及接合菌PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

3 討論

志賀菌痢疾發(fā)病率已由1980年的8%~12%降至2008年的3%[8]，但其耐藥率尤其是多重耐藥率卻逐漸上升。本研究結(jié)果顯示近2年天津地區(qū)志賀菌痢疾的流行菌型已由福氏轉(zhuǎn)變?yōu)樗蝺?nèi)氏為主，與國內(nèi)其他地區(qū)的報道類似[9]。藥敏結(jié)果顯示，本地區(qū)志賀菌對臨床常用抗菌藥普遍耐藥，對萘啶酸、氨芐西林和復(fù)方磺胺甲口惡唑的敏感率均低于5%，對阿米卡星、呋喃唑酮敏感率相對較高。5株氟喹諾酮耐藥菌均為福氏志賀菌，耐藥率為4.2%。對三代頭孢敏感率均高于90%，未出現(xiàn)加酶抑制劑類及碳青霉稀類抗生素耐藥菌。

志賀菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制主要包括染色體介導(dǎo)耐藥和質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥，其中染色體介導(dǎo)的靶位酶基因突變占主導(dǎo)地位。DNA解旋酶是主要作用靶位，但要形成顯著耐藥，拓撲異構(gòu)酶Ⅳ基因也必須同時發(fā)生變異，且突變數(shù)目越多、范圍越大，耐藥程度也越高，尤其是涉及第2靶酶ParC[10]。本研究中5株氟喹諾酮耐藥菌耐藥程度均較高，其中N8、F44對3、4代氟喹諾酮類藥物同時耐藥。耐藥菌在gyrA、parC基因均有突變，突變株中均有g(shù)y?rA83（Ser→Leu）及parC80（Ser→Ile）位點突變，其中左氧氟沙星耐藥株N8與其余4株菌相比缺乏gyrA基因87位點突變，但攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因qnrS1，分析其對左氧氟沙星的耐藥性可能與之相關(guān)。其余4株菌均同時存在gyrA87（Asp→Gly、Asn）位點突變，但只有F44表現(xiàn)出對左氧氟沙星耐藥。此外，本研究藥敏結(jié)果顯示，菌株3171、1113、4536具有相同的基因突變表型，但對諾氟沙星和左氧氟沙星的耐藥程度不同，考慮存在如外排泵基因過表達等其他機制協(xié)同作用，具體原因有待進一步研究。另有菌株3171 gyrA 176位點GTA（His）?GGA（Pro）突變，但位于QRDR區(qū)外，與氟喹諾酮類藥物耐藥的相關(guān)性也有待進一步證實。

PMQR主要介導(dǎo)低水平耐藥，是對靶位酶突變機制的補充，但其可以借助可移動元件如整合子與ISCR等通過質(zhì)粒接合、轉(zhuǎn)化等傳遞方式在不同菌株甚至不同菌群之間傳播，導(dǎo)致耐藥的廣泛播散。志賀菌中質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因包括qnrA、qnrB、qnrS、aac（6′）-ib-cr及qepA，不同地區(qū)檢出率不同。本研究共檢出3株P(guān)MQR基因陽性株，qnrS1陽性菌N8為福氏志賀菌，對氟喹諾酮耐藥；aac（6′）-ib-cr基因陽性菌均為宋內(nèi)氏志賀菌，對氟喹諾酮敏感。N8及aac（6′）-ib-cr陽性菌F8成功通過質(zhì)粒接合試驗將耐藥基因轉(zhuǎn)移到受體菌中，qnrS1及aac（6′）-ib-cr基因分別使受體菌對環(huán)丙沙星、氧氟沙星及左氧氟沙星的MIC增加了16、8、16倍及4、4、2倍，但都達不到臨床意義的耐藥臨界值，進一步印證了PMQR基因介導(dǎo)低水平耐藥的推斷，并提示qnr介導(dǎo)喹諾酮耐藥程度要高于aac（6′）-ib-cr。在gy?rA、parC雙基因雙位點突變的基礎(chǔ)上，qnrS1基因可以顯著提高N8耐藥水平，但靶位酶基因突變與qnr基因捕獲的先后有待進一步研究。

綜上，本地區(qū)近2年志賀菌主要流行菌型為宋內(nèi)氏志賀菌，對多種抗生素耐藥率較高，且多重耐藥菌株比例高。對氟喹諾酮類藥物耐藥率低，且耐藥菌全部為福氏志賀菌。志賀菌氟喹諾酮藥物耐藥機制同時存在染色體介導(dǎo)的靶位酶突變及攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因，但以靶位酶突變?yōu)橹鳌?/p>

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