寧 軍 寧 濤
(開原市園林局,遼寧開原112300)
1.緒論。銀中楊是以銀白楊為母本,中東楊為父本的人工雜交而成,該樹種生長迅速,材質(zhì)結(jié)構(gòu)細密,結(jié)實,抗旱,耐寒(抗低溫-39?C),是優(yōu)良造林樹種,其樹干通直,樹皮光滑,灰綠色,葉被面呈銀白色,樹形美觀,風(fēng)格獨特,雄系,無性系不飛絮,是城鄉(xiāng)綠化,美化,凈化環(huán)境的優(yōu)良樹種。本試驗的地點是遼寧省開原市石臺苗圃,試驗時間是2006年至2007年。
2、材料與方法
2.1 試驗材料
2.1.1 植物材料
本試驗的材料來源:銀中楊二年生植株上的當(dāng)年生幼嫩枝條。本試驗采取的外植體有兩種,即幼嫩莖段(包括莖尖)。
2.1.2 試驗所用的試劑:MS配方中的大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物。植物激素類物質(zhì):6-BA,NAA。消毒劑及表面滅菌劑:75%的酒精,0.1%的升汞溶液。
2.2 試驗方法
2.2.1 外植體的采取及處理
6月上旬開始在苗圃地選擇生長健壯、無病蟲害的二年生植株作為外植體來源,選擇晴天上午剪取當(dāng)年生幼嫩枝條,帶回實驗室后用自來水沖洗,去掉表面泥沙污物,放入燒杯中,加入適量洗滌劑攪勻,浸泡6-7min后倒掉洗滌劑溶液,在流水下沖洗30min左右,以清洗掉材料表面的油脂性污物。
2.2.2 外植體的表面滅菌
將沖洗過的材料移入超凈工作臺上進行表面滅菌,表面滅菌劑用0.1%的升汞溶液,為了提高滅菌效果,在表面滅菌前將材料用70%的酒精進行漂洗,具體方法是:取滅過菌的玻璃燒杯,倒入70%的酒精,將材料浸入酒精中,輕輕晃動4-5min后倒出酒精,表面滅菌為了增加滅菌效果,在表面滅菌劑升汞中加入2-3滴吐溫-80,充分攪勻,用無菌水沖清洗材料6-8次,每次清洗時讓材料在無菌水中浸泡1-2min,盡量減少升汞在植物組織中的殘留。清洗后的材料用濾紙吸取表面多余的水分,以備接種。
2.2.3 培養(yǎng)基
銀中楊組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中細胞分裂素的種類是6-BA,生長素的種類是NAA,二者的不同濃度和比例可以誘導(dǎo)不同的外植體脫分化。幼莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+6-BA1.0+NAA0.05(單位:mg/L,以下同)。繼代增殖培養(yǎng)基:MS+6-BA0.5+NAA0.05。生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基:1/2MS+NAA-0.50 pH值為5.8
2.2.4 接種
2.2.4.1 幼莖接種
將表面滅菌后的材料放在濾紙上,用鑷子剝?nèi)ト~片,用手術(shù)刀將幼莖切成1-2cm長的莖段,每個莖段保持1-2個節(jié),用鑷子將莖段基部直插到培養(yǎng)基中,是莖段的頂端向上,保持形態(tài)學(xué)的極性。還要注意使莖段上的腋芽留在培養(yǎng)基上,每個培養(yǎng)瓶中接種一個莖段。接種后用耐壓塑料薄膜封住瓶口,作好標(biāo)記,注明接種材料、名稱和接種日期。
2.2.5 培養(yǎng)條件
2.2.5.1 溫度。組織培養(yǎng)過程所要求的溫度為25±2℃。一般低于15℃時組織的生長停滯,高于30℃時對生長不利。銀中楊的培養(yǎng)溫度為25-27℃。
2.2.5.2 光照。銀中楊組培過程中的每日連續(xù)光照為:9-10h/d,光照強度1000-2000Lx。
3、培養(yǎng)過程
3.1 莖段、莖尖培養(yǎng)
外植體接種到幼莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基后20d左右,莖尖和莖段基部腫脹、膨大,頂芽和側(cè)芽逐漸發(fā)育,繼續(xù)培養(yǎng)至30-40后,形成2-3個芽的小芽叢。每4-5周為一個繼代周期,及時轉(zhuǎn)接到新的繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),經(jīng)過2-3個周期的繼代培養(yǎng),小芽叢中的芽的數(shù)量逐漸增加,芽逐漸伸長,長到2-3cm,繼代轉(zhuǎn)接時將小芽叢切割分開,轉(zhuǎn)接到新培養(yǎng)基中,兩周后觀察不同培養(yǎng)基上的叢生芽數(shù)量,芽的增殖倍數(shù)為4-9倍。莖尖和莖段接種后4-5個月可建立無性系。
3.2 生根培養(yǎng)
幼莖誘導(dǎo)的無根芽苗分切成單苗,接種到生根培養(yǎng)基中,一周左右即有不定根發(fā)生,2-3周有多條不定根發(fā)生,形成根系。為了促進不定根的分化,生根培養(yǎng)基中還可以加入2mg/L活性炭。
2.6.3 糖尿病患者 對前列腺增生患者應(yīng)重視是否有伴有糖尿病。入院時需詢問患者有無糖尿病以及相關(guān)用藥情況,并在病史中予以記錄。術(shù)前應(yīng)進行血糖、糖化血紅蛋白、血尿酸、肝腎功能等評估。注意飲食調(diào)節(jié)、血糖監(jiān)控,圍手術(shù)期間積極維持原代謝疾病的藥物治療,必要時與相關(guān)科室聯(lián)系進行相關(guān)藥物的劑量調(diào)整。
3.3 試管苗的過渡移栽
3.3.1 過渡移栽的措施
移栽前將培養(yǎng)瓶移入溫室或大棚內(nèi),打開瓶口煉苗1-2天。移栽時用鑷子取出小苗,洗去培養(yǎng)基,植入移栽基質(zhì)中,移栽基質(zhì)為園田土:河沙:珍珠巖2:1:1,移栽后用細噴頭噴透水。移栽后要保持空氣濕度在80-90%,用塑料膜罩上,并適當(dāng)遮光,一周內(nèi)保持75%遮光度,一周后增加光照,保持50%遮光度,以后逐漸增加光照。溫度保持在20-25℃。移栽初期保持基質(zhì)濕潤,但不積水。在移栽后的一周之內(nèi)不施肥,一周后可以葉面噴施0.1%的磷酸二氫鉀,每周2次,以促進根系發(fā)育,根系形成后可以隨澆水根施氮、磷鉀復(fù)合肥,每周1次,一個月后可定植到苗圃,進入正常管理。
4、問題與討論
4.1 外植體表面滅菌方法
本試驗采取以下三種不同的表面滅菌方法:第一種,0.1%升汞浸泡11min,無菌水沖洗6次。第二種,75%酒精浸泡1min,再用0.1%升汞浸泡11min,無菌水沖洗6次。第三種,75%酒精浸泡1min,再用0.1%升汞浸泡11min,升汞中加2-3滴吐溫80,無菌水沖洗6次。上述三種表面滅菌方法的滅菌效果有明顯差異,接種后2-3周的污染率和褐化率見表:
表4.1 三種滅菌方法污染率與褐化率
實驗證明,銀中楊外植體表面滅菌采用第二種方法較為合適,即先用75%酒精浸泡1min,再用0.1%升汞浸泡11min,無菌水沖洗6次。
4.2 繼代培養(yǎng)基中細胞分裂素與生長素(6-BA與NAA)對芽增殖的影響。
細胞分裂素和生長素的種類、濃度對培養(yǎng)物的生長狀況、增殖倍數(shù)起著重要的作用,適當(dāng)降低激素濃度,特別是降低生長素的濃度,培養(yǎng)物的生長和芽苗的增殖都有明顯的變化,使愈傷組織的生長受到抑制,質(zhì)地均勻、顏色變綠,而且芽苗增殖提高。本試驗以莖段培養(yǎng)物為材料,將細胞分裂素(6-BA)和生長素(NAA)做兩因素三水平的正交實驗設(shè)計,結(jié)果見表4.2。
表4.2
1 號MS+6-BA0.5+NAA0.01
2 號MS+6-BA0.5+NAA0.05
3 號MS+6-BA0.5+NAA0.1
4 號MS+6-BA1+NAA0.01
5 號MS+6-BA1+NAA0.05
6 號MS+6-BA1+NAA0.1
7 號MS+6-BA1.5+NAA0.01
8 號MS+6-BA1.5+NAA0.05
9 號MS+6-BA1.5+NAA0.1
上述9個處理均在相同條件下培養(yǎng)和轉(zhuǎn)接,經(jīng)過3個周期的培養(yǎng)和觀察,結(jié)果如下表:
表4.3 各培養(yǎng)基中芽增殖及表現(xiàn)
實驗證銀中楊適宜的繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5-1.0+NAA0.01-0.05。
[1]李世承,植物組織培養(yǎng)實驗技術(shù)[M],大連:大連理工大學(xué)出版社,1990.76-77,84-85。
[2]唐定臺,等.植物激素對哈密瓜(Cncumis meloL)子葉形成愈傷組織和植株再生的作用[J],植物學(xué)報,1980.22-2,132-134.
[3]曹宗巽,等.植物生理學(xué)[M].北京:人民教育出版社,1979.335-345