吳濟南，王麗玲，王惟帥，杜慧玲

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，030801，山西太谷)

土壤酶是催化有機物分解的一類具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的生物催化劑，土壤酶主要來源于土壤微生物和植物根系的分泌物及動植物殘體分解釋放的酶［1］，參與土壤中各種有機質(zhì)的分解、合成與轉(zhuǎn)化，以及無機物質(zhì)的氧化與還原等過程，是土壤生態(tài)系統(tǒng)代謝的一類重要動力，在很大程度上反映土壤物質(zhì)循環(huán)與轉(zhuǎn)化的強度，常被用來作為土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預(yù)警和敏感指標(biāo)［2］。而土壤酶活性易直接或間接受自然或者人為因素的影響［3］。農(nóng)藥是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最常見的一種異源物質(zhì)，很容易影響土壤酶活性［4］，因此，土壤酶活性作為一項生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)，可用來判斷外來物質(zhì)對土壤的污染程度以及可能對生態(tài)環(huán)境造成的影響。

苯磺隆(Tribenuron-methyl)由芳環(huán)、磺酰脲橋和三嗪環(huán)組成，為內(nèi)吸傳導(dǎo)型選擇性磺酰脲類除草劑，于20世紀(jì)80年代由美國杜邦公司開發(fā)，具有高效、廣譜、用量少、使用方便、低殘留等優(yōu)點，是目前麥田廣泛使用的除草劑之一。多效唑為低毒植物生長延緩劑，能夠抑制莖桿伸長，縮短節(jié)間，增加作物抗倒伏能力和抗逆性。在小麥生產(chǎn)上，為有效防止小麥后期倒伏，為小麥的高產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，常使用多效唑和追施尿素方法。杜慧玲等［5］通過盆栽試驗研究了苯磺隆對土壤酶活性的影響，結(jié)果表明，土壤脲酶活性對表征苯磺隆污染具有一定的指示作用。王正貴等［6］研究了除草劑苯磺隆對麥田土壤酶活性的影響。而苯磺隆與多效唑、尿素配施對土壤酶活性的影響尚未見報道。筆者采用盆栽試驗，研究除草劑苯磺隆與多效唑、尿素配施對土壤脲酶、堿性磷酸酶和蛋白酶的影響，旨在為環(huán)境質(zhì)量評價指標(biāo)體系的建立以及經(jīng)濟合理地使用苯磺隆，減少環(huán)境污染提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗地位于晉中盆地的太谷縣，E 112.57°，N 37.43°，屬暖溫帶大陸性氣候，年平均氣溫9.8℃，無霜期175 d，降雨量462.9 mm，地下水資源可開采量9 600 m3。農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)條件好。試驗地為石灰性褐土，質(zhì)地為中壤，未使用過除草劑。

2 材料與方法

2.1 供試材料

供試土壤采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗地。土壤理化性狀為:有機質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.85 g/kg，全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.96 g/kg，堿解氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.87 mg/kg，有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)15.58 mg/kg，速效鉀129.41 mg/kg，pH值8.3。采集0～20 cm土壤，晾干后過3 mm篩，充分混勻，選擇30 cm×26 cm的塑料盆，每盆裝土15 kg。

供試冬小麥(Triticum aestivum)品種為農(nóng)大190，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗農(nóng)場提供;10%苯磺隆可濕性粉劑，沈陽化工院生產(chǎn);15%多效唑可濕性粉劑由江蘇鹽城市磺隆實業(yè)有限公司生產(chǎn);尿素(N≥46%)由山西焦化集團有限公司生產(chǎn)。

2.2 測定方法

脲酶活性采用苯酚鈉比色法測定;蛋白酶活性采用茚三酮顯色比色法測定;磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定［1］。

2.3 試驗設(shè)計與實施

試驗采用3因素完全隨機設(shè)計，其中苯磺隆有3個水平(B、B1和B2，分別為0、5.0和100.0 mg/kg)，多效唑有2個水平(X和X1，分別為0和750 g/hm2)，尿素有2個水平(N和N1，分別為0和300 kg/hm2)，共12個處理組合:1)對照(B=0，X=0，N=0)(CK);2)低濃度苯磺隆(B1);3)高濃度苯磺隆(B2);4)多效唑(X1);5)低濃度苯磺隆+多效唑(B1X1);6)高濃度苯磺隆+多效唑(B2X1);7)尿素(N1);8)低濃度苯磺隆+尿素(B1N1);9)高濃度苯磺隆+尿素(B2N1);10)多效唑+尿素(X1N1);11)低濃度苯磺隆+多效唑+尿素(B1X1N1);12)高濃度苯磺隆+多效唑+尿素(B2X1N1)。每個處理3次重復(fù)。

于小麥返青后拔節(jié)前按試驗設(shè)計濃度噴施，處理后1、3、7、14、28、60 d 進行采樣，測定土壤脲酶、堿性磷酸酶、蛋白酶活性。

2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 8.1軟件進行方差分析，用Duncan新復(fù)極差法進行平均數(shù)的顯著性檢驗。

3 結(jié)果與分析

3.1 尿素、多效唑配施對苯磺隆脅迫下土壤脲酶的影響

由土壤脲酶方差分析結(jié)果表1可以看出，用藥后1～60 d，苯磺隆、多效唑(除第3 d)、尿素的主效應(yīng)對土壤脲酶活性的影響達(dá)極顯著差異水平，苯磺隆與尿素二因素以及苯磺隆、多效唑與尿素3因素互作除第1 d外均達(dá)極顯著差異水平。

表1 土壤脲酶方差分析結(jié)果Tab.1 F-value variance analysis results on soil urease

尿素、多效唑配施對苯磺隆脅迫下土壤脲酶活性的影響，各處理之間的多重比較結(jié)果見表2?？梢钥闯?與對照相比，B1、B2處理，在最初14 d呈抑制效應(yīng)，且抑制作用隨著苯磺隆濃度的增大而增大，1～7 d抑制率隨著時間的延長而增大，第7 d達(dá)到最大，分別為59.4%和74.8%;28～60 d呈激活效應(yīng)，第60 d，B1處理基本恢復(fù)到對照水平，B2處理極顯著地高于對照，激活率高達(dá)183.0%;B1X1處理在1～7 d表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，抑制效應(yīng)小于B1處理，14～60 d呈激活效應(yīng)，比B1處理激活效應(yīng)提前;B2X1處理與B2處理相比，在第3 d和第7 d抑制率顯著提高，第3 d由60.0%提高為78.8%，第7 d由74.8%提高為88.0%，第60 d激活率為109.2%，小于B2處理;B1N1處理，除第1 d呈輕微的抑制效應(yīng)外，第3～60 d均呈激活效應(yīng)，差異水平達(dá)極顯著;B2N1處理在1～7 d呈較弱的抑制效應(yīng)，之后呈極顯著的激活效應(yīng);B1N1X1與B1相比，B2N1X1與B2相比，同一時間酶活性均顯著增加。在整個處理過程，與對照相比，B1和B2脲酶活性平均增加了-11.0%和 -7.27%，而B1N1X1和B2N1X1處理，脲酶活性平均增加29.8%和38.4%。說明配施尿素和多效唑，可以緩解甚至消除苯磺隆對脲酶活性的抑制作用。

表2 不同處理間土壤脲酶多重比較結(jié)果Tab.2 Multiple comparisons results of soil urease between different treatments mg/(g·h)

3.2 尿素、多效唑配施對苯磺隆脅迫下土壤堿性磷酸酶的影響

土壤磷酸酶有酸性、中性和堿性3類，測定的最適pH值分別為5.0、7.0和9.8。由于供試土壤為石灰性堿性土壤，故只進行了堿性磷酸酶的研究。

土壤堿性磷酸酶方差分析結(jié)果表3表明，1～60 d，苯磺隆對土壤堿性磷酸酶活性的主效應(yīng)以及苯磺隆與尿素2因素互作均達(dá)顯著或極顯著差異水平，苯磺隆與多效唑互作除第1 d和第28 d，多效唑與尿素互作除第60 d不顯著外，其余時間均達(dá)顯著或極顯著水平，苯磺隆、多效唑與尿素3因素互作在處理的最初7 d達(dá)極顯著。

表3 土壤堿性磷酸酶方差分析結(jié)果Tab.3 F-value variance analysis results on soil alkaline phosphatase

尿素、多效唑配施對苯磺隆脅迫下土壤堿性磷酸酶的影響，各處理之間的多重比較結(jié)果見表4?？芍?低濃度苯磺隆對堿性磷酸酶活性表現(xiàn)為激活—抑制—激活作用，高濃度苯磺隆表現(xiàn)為抑制—激活作用，第60 d極顯著地高于對照，是對照的2.49倍;尿素、多效唑配施后表現(xiàn)為抑制—激活作用，各處理在第1～28 d堿性磷酸酶活性隨著時間的延長而增大，其中14～28 d磷酸酶活性變化不大，之后急劇降低，處理結(jié)束時極顯著地高于對照;在整個處理過程中，與對照相比，B1、B1X1、B1N1、B1N1X1各處理堿性磷酸酶活性平均增加分別為3.22%、1.39%、-2.42%、-4.88%，B2、B2X1、B2N1、B2N1X1各處理堿性磷酸酶活性平均增加為-9.79%、-2.39%、3.95%、-4.56%。說明低濃度苯磺隆對堿性磷酸酶具有激活效應(yīng)，配施尿素和多效唑，低濃度苯磺隆與尿素和多效唑表現(xiàn)為拮抗作用，減弱了其激活效應(yīng);高濃度苯磺隆對堿性磷酸酶具有抑制作用，尿素、多效唑可以緩解甚至消除高濃度苯磺隆對堿性磷酸酶活性的抑制作用，高濃度苯磺隆與多效唑表現(xiàn)為拮抗作用，與尿素表現(xiàn)為加和作用。

表4 不同處理間土壤堿性磷酸酶多重比較結(jié)果Tab.4 Multiple comparisons results of soil alkaline phosphatase between different treatments μg/(g·h)

3.3 尿素、多效唑配施對苯磺隆脅迫下土壤蛋白酶的影響

土壤蛋白酶方差分析結(jié)果見表5?？梢钥闯?，苯磺隆、尿素、多效唑主效應(yīng)以及交互效應(yīng)對土壤蛋白酶的影響在不同處理時間大多不顯著，特別是第1 ～7 d。

尿素、多效唑配施對苯磺隆脅迫下土壤蛋白酶的影響，各處理之間的多重比較結(jié)果見表6?？芍?除B1和B1N1處理外，其余苯磺隆以及苯磺隆配施尿素、多效唑各處理對土壤蛋白酶活性的影響表現(xiàn)為先抑制后激活，B1處理表現(xiàn)為激活—抑制作用，直到處理結(jié)束還沒有恢復(fù)到對照水平;B1N1處理第1天表現(xiàn)為極顯著的激活作用，之后為抑制作用;B2X1處理在第28天酶活性最強，與對照相比激活率為65.94%。在整個處理過程中，與對照相比，各處理酶活性平均降低順序為B1N1(6.92%)＜B1X1(7.07%)＜B1(8.37%)＜B1N1X1(20.26%)。說明低濃度苯磺隆同時與尿素和多效唑施用對土壤蛋白酶抑制作用增強，第7天抑制作用最強，抑制率為59.74%，低濃度苯磺隆與尿素和多效唑表現(xiàn)為拮抗作用。高濃度苯磺隆各處理酶活性與對照相比平均降低順序為B2X1(0.00%)＜B2N1X1(2.54%)＜B2N1(9.61%)＜B2(25.1%)。說明高濃度苯磺隆配施尿素、多效唑顯著降低了對土壤蛋白酶的抑制作用，高濃度苯磺隆與尿素表現(xiàn)為協(xié)同作用，與多效唑表現(xiàn)為拮抗作用。

表5 土壤蛋白酶方差分析結(jié)果Tab.5 F-value variance analysis results on soil protease

表6 不同處理間土壤蛋白酶多重比較結(jié)果Tab.6 Multiple comparisons results of soil protease between different treatments μg/(g·h)

4 結(jié)論與討論

1)在整個處理過程中，苯磺隆與尿素和多效唑配施對脲酶活性表現(xiàn)為先抑制后激活，且隨著濃度增加抑制和激活增強。與對照相比，對于脲酶活性主要表現(xiàn)為激活效應(yīng)，具體順序為:B2N1X1＞B1N1X1＞B1N1＞B2N1＞B1X1＞B2X1＞B1＞B2。

2)堿性磷酸酶活性表現(xiàn)為高濃度苯磺隆具有抑制作用，低濃度苯磺隆具有輕微的激活效應(yīng)。低濃度苯磺隆與尿素、多效唑混用酶活性降低，酶活性平均增加順序為:尿素(9.14%)＞尿素+多效唑(7.27%)＞低濃度苯磺隆(3.22%)＞低濃度苯磺隆+多效唑(1.39%)＞低濃度苯磺隆+尿素(-2.42%)＞多效唑(-4.70%)＞低濃度苯磺隆+尿素+多效唑(-4.88%)。高濃度苯磺隆與尿素、多效唑混用減弱了對酶活性的抑制作用，順序為:尿素(9.14%)＞尿素+多效唑(7.27%)＞高濃度苯磺隆+尿素(3.95%)＞高濃度苯磺隆+多效唑(-2.39%)＞高濃度苯磺隆+尿素+多效唑(-4.56%)＞多效唑 (-4.70%)＞高濃度苯磺隆(-9.79%)。

3)苯磺隆對土壤蛋白酶活性表現(xiàn)為抑制作用，且隨著濃度的增大抑制作用增強，B1、B2處理平均抑制率分別為8.37%和25.08%。添加多效唑、尿素(除B1X1N1處理外)可減弱苯磺隆對土壤蛋白酶的抑制作用。

農(nóng)藥對土壤酶活性的影響與施用的土壤類型、土壤環(huán)境、氣候條件、農(nóng)藥結(jié)構(gòu)、農(nóng)藥用量及施用時間、研究方法以及取樣時間等諸多因素有關(guān)［7］。土壤脲酶能促進土壤尿素分子中酰胺碳氮鍵的水解，生成的氨是植物氮素營養(yǎng)來源之一，在氮肥利用和土壤氮素代謝方面有重要的意義［8］。農(nóng)藥對土壤脲酶的影響已有許多報道［9-11］。本研究表明，苯磺隆對脲酶活性為先抑制后激活，隨著苯磺隆濃度的增加抑制和激活作用均增強。說明抑制作用是一種暫時現(xiàn)象，微生物能很快適應(yīng)外來有機物的干擾，并利用苯磺隆作為碳源，使酶活性增強。配施尿素、多效唑能夠緩解對脲酶的抑制作用。這是因為苯磺隆及其降解產(chǎn)物與尿素、多效唑分子間形成范德華力和氫鍵，降低了苯磺隆對土壤脲酶的毒性，且隨著處理時間的延長，為微生物提供了較多碳源和能源，從而激活了脲酶活性。

土壤磷酸酶是能促進有機磷酯或無機磷酸鹽轉(zhuǎn)化為植物可利用的無機磷酸，可為植物生長提供有效磷素。李兆君等［12］的研究結(jié)果表明，甲磺隆結(jié)合殘留對土壤酸性磷酸酶和過氧化氫酶具有明顯的抑制作用。馬愛軍等［13］報道，毒死蜱與乙草胺單一污染和復(fù)合污染對酸性磷酸單酯酶以及堿性磷酸單酯酶的影響表現(xiàn)為先激活后抑制的效應(yīng)。本研究表明，低濃度苯磺隆對堿性磷酸酶的影響表現(xiàn)為先激活后抑制再激活的效應(yīng)。這是由于微生物能夠利用苯磺隆作為碳源和能源刺激自身的生長，從而使堿性磷酸酶活性被激活;但隨著苯磺隆的降解，可利用的碳源和能源減少，堿性磷酸酶活性暫時降低，隨著小麥的生長，根際環(huán)境的變化又有利于酶活性的恢復(fù)或增強。配施多效唑、尿素，堿性磷酸酶活性降低，說明低濃度苯磺隆與多效唑表現(xiàn)為協(xié)同作用，與尿素以及尿素+多效唑表現(xiàn)為拮抗作用。高濃度苯磺隆配施多效唑、尿素對堿性磷酸酶仍然呈抑制作用，這是由于苯磺隆等有機污染物改變了土壤酶的構(gòu)象等。

土壤蛋白酶是氮素轉(zhuǎn)化的重要酶類，能水解各種蛋白質(zhì)和肽類等化合物為氨基酸，因此，土壤蛋白酶的活性與土壤氮素營養(yǎng)的轉(zhuǎn)化狀況存在極重要的關(guān)系［14］。滕春紅等［10］研究氯嘧磺隆對蛋白酶的影響結(jié)果表明，低濃度氯嘧磺隆對蛋白酶有輕微的激活作用，而高濃度氯嘧磺隆對蛋白酶有抑制作用。本研究表明，低濃度苯磺隆最初3d刺激了酶活性，之后對酶活性呈抑制作用;高濃度苯磺隆在處理后的第14天表現(xiàn)為抑制作用，第28～60天表現(xiàn)為激活作用。這是因為低濃度苯磺隆刺激了微生物活性，而高濃度苯磺隆對微生物有不良影響。處理初期，由于苯磺隆分子中的磺酰脲橋被蛋白酶水解，使酶分子的活性部位減少，從而抑制了底物與酶分子結(jié)合，進而降低了酶活性，之后，有機物分解增加了碳源和氮源，從而提高了微生物的活性。從酶活性平均增加現(xiàn)象可見，配施多效唑、尿素減弱了苯磺隆對土壤蛋白酶的抑制作用，但B1N1X1處理對酶活性的抑制作用增強，其作用機制有待進一步研究。

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