丁海峰,曹永兵,劉洪濤,牟 斌,姜遠英(第二軍醫(yī)大學藥學院藥理學教研室)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一組與自身免疫相關的腸道炎癥性疾病,好發(fā)于乙狀結腸和直腸。臨床癥狀以腹痛、腹瀉、黏液、膿血便和里急后重為主,發(fā)病機制尚不明確,病程纏綿,反復發(fā)作,是胃腸道的疑難病。近年來,其發(fā)病率呈明顯上升趨勢,但目前尚無特異性治療方法[1]。臨床主要采用激素和水楊酸制劑治療,癥狀嚴重時合用抗生素,由于嚴重不良反應的存在,均無法長期用藥,因此開發(fā)新的安全有效的治療藥物顯得十分迫切。腸炎沖劑是由黃柏、地錦草等制成的復方制劑,臨床應用于治療UC多年。本研究進一步證實了腸炎沖劑對實驗動物胃腸的調節(jié)功能及止瀉作用。

1 材料和方法

1.1 儀器 張力換能器和PowerLab數(shù)據記錄與分析系統(tǒng)(澳大利亞AD Instruments公司);麥氏浴槽(江蘇省張家港市青松生物醫(yī)學儀器有限公司);Lambda25型可見-紫外分光光度計(美國PerkinElmer公司)。

1.2 試劑和藥品 番瀉葉(上海雷允上中藥飲片廠);蓖麻油(第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院藥學部自制,批號020909);鹽酸小檗堿(上海利生制藥廠,批號Y-001-0001);羧甲基纖維素鈉(CMCNa,中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑有限公司,批號F20050913,用蒸餾水配成所需濃度);阿托品注射液(上海禾豐制藥有限公司,批號020101,用0.5%CMCNa配成0.01 mg/ml的溶液);甲硫酸新斯的明注射液(規(guī)格:0.5 mg/ml,上海信誼金朱藥業(yè)有限公司,批號020401);氯化乙酰膽堿(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑有限公司,批號 20020122,用三蒸水配成0.4 mg/ml的溶液);酚紅(上海三愛思試劑有限公司,批號990122,用 2%CMCNa配成0.7 mg/L溶液)。腸炎沖劑由第二軍醫(yī)大學藥學院藥理學教研室自制,用0.5%CMCNa碾磨混懸均勻,分別配成1.14 、0.57、0.29 g生藥/ml的藥液。

1.3 動物 SD大鼠[清潔級,第二軍醫(yī)大學實驗動物中心,動物合格證號:SCXK(滬)2002-0006],雌雄各半,體重250～300 g;ICR小鼠[清潔級,中國科學院上海實驗動物中心,動物合格證號:SCXK(滬)2002-0010],雌雄不限,體重18～22 g;白色家兔[第二軍醫(yī)大學實驗動物中心,動物合格證號:SCXK(滬)2005-0003],雌雄各半,體重1.8～2.2 kg。

1.4 大鼠正常小腸推進運動的實驗[2]取50只SD大鼠,按體重以數(shù)字化隨機法分為5組,各組給藥體積均為10 ml/kg體重。腸炎沖劑高、中、低劑量組分別灌胃給予1.14、0.57、0.29 g生藥/ml的腸炎沖劑溶液,即高、中、低劑量組的給藥劑量分別為11.4、5.7、2.9 g生藥/kg體重?？瞻讓φ战M灌胃給予0.5%CMCNa溶液,陽性對照組灌胃給予0.01 mg/ml的阿托品溶液。每天給藥1次,連續(xù)3 d,進行碳末推進實驗前,大鼠禁食過夜。末次給藥1 h后,灌胃給予活性炭混懸液(用0.5%CMCNa配成0.1 g/ml混懸液)10 ml/kg體重,30 min后斷頸處死大鼠,打開腹腔,分離腸系膜,剪取幽門至回盲部的腸管置于托盤上,輕輕將小腸拉成直線,測量腸管長度作為小腸總長度。以幽門至炭末前沿的距離作為炭末在腸內推進距離,計算炭末推進百分率和藥物的抑制率。炭末推進百分率=[炭末在腸內推進距離/小腸總長度]×100%,藥物的抑制率=[(空白對照組炭末推進百分率-給藥組炭末推進百分率)/空白對照組炭末推進百分率]×100%。

1.5 小鼠推進機能亢進小腸運動的實驗[2]取ICR小鼠 60只,雌雄各半,按體重以數(shù)字化隨機法分為6組,各組給藥體積均為15 ml/kg體重。給藥組分別灌胃給予1.14、0.57、0.29 g生藥/ml的腸炎沖劑溶液,則給藥劑量分別為17.1、8.6、4.3 g生藥/kg體重。模型對照組和空白對照組均灌胃給予0.5%CMCNa,陽性對照組灌胃給予0.01 mg/ml的阿托品溶液,每天給藥 1次,連續(xù)3 d。末次給藥1 h后,除空白對照組外,其余各組均皮下注射新斯的明0.1 g/kg體重造模,15 min后進行炭末推進實驗,計算炭末推進百分率和藥物的抑制率。炭末推進百分率計算與1.4項下相同。藥物的抑制率=[(模型對照組炭末推進百分率-給藥組炭末推進百分率)/模型對照組炭末推進百分率]×100%。

1.6 家兔離體十二指腸平滑肌活動的實驗[3,4]取家兔40只,雌雄各半,按體重以數(shù)字化隨機法分為5組,即空白對照組、陽性對照組(阿托品)及腸炎沖劑高、中、低劑量組,每組8只。所有家兔在實驗前禁食24 h,擊頭致死,立即剖腹,取出一段十二指腸,迅速于冷臺氏液中保存。實驗時剪取1.5 cm腸段,懸吊在37℃、39 ml臺氏液的麥氏浴槽中(pH值7.2～7.4),通100%氧氣,靜息張力0.5 g,平衡0.5 h后開始實驗,以張力換能器測定肌內收縮力,用PowerLab進行數(shù)據記錄與分析。(1)對家兔離體十二指腸平滑肌自發(fā)活動的影響 按上述操作后,描記正常收縮曲線,各組分別加入1.14、0.57、0.29 g生藥/ml腸炎沖劑藥液,阿托品溶液和0.5%CMCNa各1 ml,描記加藥后的收縮曲線。(2)對氯化乙酰膽堿所致腸痙攣的影響 按上述操作常規(guī)制備家兔離體腸標本,描記正常收縮曲線,然后在浴槽內加入0.4 mg/ml氯化乙酰膽堿0.2 ml(終濃度為2 μ g/ml),引起腸管痙攣,待其平穩(wěn)后,向浴槽內分別加入1.14、0.57、0.29 g生藥/ml腸炎沖劑藥液、阿托品溶液和0.5%CMCNa各1 ml,描記加藥后收縮曲線。

1.7 大鼠胃排空實驗[5]取SD大鼠40只,按體重以數(shù)字化隨機法分為5組,各組給藥體積均為10 ml/kg體重?？瞻讓φ战M灌胃給予0.5%CMCNa溶液,陽性對照組灌胃給予1 mg/ml的阿托品溶液,腸炎沖劑高、中、低劑量組分別每天灌胃給予1.14、0.57、0.29 g生藥/ml的腸炎沖劑藥液,連續(xù)3 d。胃排空實驗前大鼠禁食過夜。末次給藥后2 h,每只大鼠灌胃給予0.07%酚紅溶液1.5 ml,15 min后處死大鼠,立即取胃,將胃內容物洗在10 ml蒸餾水中,3.0×103g離心 10 min,取上清液在546 nm波長測定吸光度。另取10 ml蒸餾水加入0.07%酚紅溶液1.5 ml,離心后測定其546 nm的吸光度作為基礎值,計算胃內酚紅殘留率。胃內酚紅殘留率=(各組 A546值/基礎 A546值)×100%。

1.8 止瀉實驗[6](1)番瀉葉致瀉實驗 造模前1 d用番瀉葉25 g加水300 ml,直火煎煮15 min,用紗布過濾,在水浴鍋上濃縮成1 g/ml溶液備用。取ICR小鼠60只,雌雄各半,按體重以數(shù)字化隨機法分為6組,各組給藥體積均為15 ml/kg體重?？瞻讓φ战M和模型對照組灌胃給予0.5%CMCNa溶液,陽性對照組 予1.0的 酸 檗堿,腸炎沖劑高、中、低劑量給藥組分別灌胃給予濃度為1.14、0.57、0.29 g生藥/ml的腸炎沖劑藥液,即給藥劑量分別為17.1、8.6、4.3 g生藥/kg體重,連續(xù)5 d。除空白對照組外,各組于末次給藥后1 h口服番瀉葉煎液0.02 ml/g體重。每鼠單籠放置,籠底墊干凈濾紙,每小時換1次紙,計數(shù)5 h內干糞數(shù)和濕糞數(shù),計算稀便率。稀便率=(稀便數(shù)/總便數(shù))×100%。(2)蓖麻油致瀉實驗 另取 ICR小鼠 60只,雌雄各半,按體重以數(shù)字化隨機法分為6組。各組給藥劑量與番瀉葉致瀉實驗相同,每天給藥1次,連續(xù)5 d。除正常對照組外,其余各組均于末次給藥后1 h口服蓖麻油0.02 ml/g體重,記錄糞便數(shù)量并計算稀便率。

2 結 果

2.1 對正常大鼠小腸推進運動的影響 空白對照組平均炭末推進百分率為(72.01±5.77)%,腸炎沖劑高、中、低劑量組和陽性對照組(阿托品)的平均炭末推進百分率為(53.93±5.71)%、(65.98±7.94)%、(68.10±6.98)%和(66.24±5.61)%,抑制率分別為25.11%、8.37%、5.43%和8.01%。腸炎沖劑高、中劑量組和陽性對照組的炭末推進百分率與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,P＜0.001),表明高、中劑量的腸炎沖劑和阿托品均能顯著抑制大鼠正常小腸的推進運動。腸炎沖劑低劑量組的炭末推進百分率與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義,但仍顯示抑制趨勢。

2.2 對小鼠推進機能亢進小腸運動的影響 腸炎沖劑對ICR小鼠推進機能亢進小腸運動的影響實驗中,空白對照組和模型對照組的平均炭末推進百分率分別為(66.29±16.04)%和(77.46±13.94)%,腸炎沖劑高、中、低劑量組和陽性對照組(阿托品)的平均炭末推進百分率分別為(54.98±7.07)%、(69.20±7.25)%、(70.79±10.98)%和(74.79±15.38)%,藥物的抑制率分別為29.02%、10.66%、8.61%和 3.45%。皮下注射新斯的明0.1 g/kg體重能引起ICR小鼠小腸推進機能亢進。腸炎沖劑高劑量組的炭末推進百分率與模型對照組相比差異有統(tǒng)計學意義,表明高劑量的腸炎沖劑能顯著抑制新斯的明導致的推進機能亢進小腸的運動機能,腸炎沖劑中、低劑量組及陽性對照組與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義,但仍有抑制推進機能亢進小腸運動的趨勢。

2.3 對家兔離體十二指腸平滑肌活動的影響 陽性對照組和腸炎沖劑高、中劑量組對家兔平滑肌自發(fā)活動的收縮張力與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義,說明阿托品和高、中劑量的腸炎沖劑能顯著抑制家兔離體十二指腸段自發(fā)活動。陽性對照組和腸炎沖劑高、中劑量組對氯化乙酰膽堿所致腸痙攣的收縮張力與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義,說明腸炎沖劑和阿托品均能顯著抑制氯化乙酰膽堿所致腸痙攣,結果見表1。

表1 腸炎沖劑對家兔離體十二指腸平滑肌收縮張力的影響Table 1 The effect of Changyan granules on contraction tension of isolated duodenal smooth muscle in rabbits

表1 腸炎沖劑對家兔離體十二指腸平滑肌收縮張力的影響Table 1 The effect of Changyan granules on contraction tension of isolated duodenal smooth muscle in rabbits

*P＜0.05,***P＜0.001,與空白對照組比較

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2.4 對大鼠胃排空的影響 空白對照組和陽性對照組大鼠的胃內殘留率分別為(46.79±32.13)%和(97.06±24.96)%,兩組相比差異有統(tǒng)計學顯著意義(P＜0.01),說明10 mg/kg體重的阿托品能顯著抑制大鼠的胃排空功能。腸炎沖劑高、中、低劑量組的胃內殘留率分別為(40.33±25.94)%、(27.75±10.96)%和(36.06±18.24)%,與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義,說明各劑量的腸炎沖劑對SD大鼠的胃排空功能沒有影響。

2.5 止瀉效果 (1)對番瀉葉致瀉的止瀉效果 空白對照組未見稀便,模型對照組的稀便率為(80.11±14.99)%,表明番瀉葉煎液能誘導小鼠腹瀉。陽性對照組(鹽酸小檗堿)和腸炎沖劑高劑量組的稀便率分別為(51.43±23.61)%和(60.15±15.95)%,與模型對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。腸炎沖劑中、低劑量組的稀便率分別為(73.34±13.75)%和(71.36±16.08)%,與模型對照組相比差異無統(tǒng)計學意義,但仍有止瀉趨勢,并呈一定的劑量相關性。(2)對蓖麻油致瀉的止瀉效果 空白對照組未見稀便,模型對照組的稀便率為(81.44±14.23)%,表明蓖麻油致瀉造模成功。腸炎沖劑高、中、低劑量組和陽性對照組的稀便率分別為(72.51±17.13)%、(71.01±13.20)%、(76.86±17.08)%和(71.03±10.43)%,與模型對照組相比差異無統(tǒng)計學意義,稀便率與劑量的相關性也不明顯。

3 討 論

近年來,中醫(yī)藥治療UC取得一定進展,但療效好的內服中藥較少。腸炎沖劑是在民間驗方基礎上經刪改而成的復方制劑,其中的黃柏、地錦草等具有抗菌、抗炎、抗?jié)?以及免疫調節(jié)作用,臨床常用于治療腸炎、菌痢等疾病。以往的研究表明,腸炎沖劑能夠明顯緩解UC模型大鼠的腹瀉癥狀,降低結腸組織髓過氧化物酶活力,改善結腸組織病理學改變,使?jié)兠娣e明顯縮小,緩解水腫[7]。本研究結果表明,腸炎沖劑對大鼠正常小腸及推進機能亢進小鼠的小腸運動均有明顯抑制作用,能顯著抑制離體家兔十二指腸平滑肌的收縮運動和氯化乙酰膽堿所致腸痙攣,可能由于藥方中含有的黃柏堿成分具有輕度的筒箭毒樣作用,能抑制由乙酰膽堿引起的收縮反應。止瀉實驗結果顯示,腸炎沖劑對番瀉葉所致的小鼠腹瀉有止瀉作用,但對蓖麻油引起的腹瀉無明顯效果。分析原因可能與蓖麻油除了刺激小腸,增加腸蠕動,促進排泄外,還具有一定的潤腸作用有關。此外,腸炎沖劑對胃功能未見明顯影響?？傊?本研究結果為腸炎沖劑的臨床應用提供了理論依據。

[1] 劉 莉,梅其炳,周四元,等.大黃多糖對T NBS誘導大鼠結腸炎的治療作用[J].中國中藥雜志,2003,28(3):246-249.Liu Li,Mei QiBing,Zhou SiYuan,et al.Effects of tanguticum maxim polysaccharide on ulcerative colitis induced by T NBS in rats[J].China J Chin Materia Medica,2003,28(3):246-249.Chinese with abstract in English.

[2] 陳文莉,郭良集.加味痛瀉要方對小鼠小腸推進及藥物性腹瀉的影響[J].山西中醫(yī)學院學報,2006,7(4):13-14.Chen WenLi,Guo LiangJi.Effect of Jiawei T ongxie decoction on small intestine propulsion and medicamentous diarrhea of mice[J].J Shanxi Coll Tradit Chin Med,2006,7(4):13-14.Chinese with abstract in English.

[3] 劉和莉,武海軍,徐繼輝,等.暖宮七味膠囊對兔離體腸平滑肌的作用[J].包頭醫(yī)學院學報,2002,18(2):91-92.Liu HeLi,Wu HaiJun,Xu JiHui,et al.Effect of Nuangongqiwei capsule on isolated rabbit intestinal smooth muscle[J].J Baotou Med Coll,2002,18(2):91-92.Chinese with abstract in English.

[4] 張 婷,王敏偉,陳思維.吳茱萸湯醇提各組分止嘔活性的研究[J].中國中藥雜志,2002,27(11):862-866.Zhang T ing,Wang MinWei,Chen SiWei.Anti-emetic effect of ethanol extract from“Wuzhuyu Broth”[J].China J Chin M ateria M edica,2002,27(11):862-866.Chinese with abstract in English.

[5] 王貴林,涂獻玉,馬鳳英,等.通降胃靈片對胃腸功能影響的研究[J].中藥藥理與臨床,2001,17(2):37-38.Wang GuiLin,Tu XianYu,Ma FengYing,et al.The experimental study on effects of T ongjiangweiling tablets on the gastrointestinal function[J].Pharmacol Clin Chin Materia Medica,2001,17(2):37-38.Chinese with abstract in English.

[6] 熊德鑫,崔云龍,萬阜昌,等.酪立寧膠囊對實驗性腹瀉小鼠的止瀉作用[J].中國新藥雜志,2002,11(4):319-321.Xiong DeXin,Cui YunLong,Wan FuChang,et al.Anti-diarrhea effect of Laolining capsule on mice with experimental diarrhea[J].Chin J New Drug s,2002,11(4):319-321.Chinese with abstract in English.

[7] 曹永兵,張軍東,閻 瀾,等.腸炎沖劑對潰瘍性結腸炎模型大鼠的治療作用[J].藥學服務與研究,2004,4(2):114-116.Cao YongBing,Zhang JunDong,Yan Lan,et al.The efficacy of Changyan granules in treatment of chronic ulcerative colitis model rats[J].Pharm Care Res,2004,4(2):114-116.Chinese with abstract in English.