檀碧波，李 勇，韓 杰，范立僑，劉 羽，張志棟

在胃癌的發(fā)生發(fā)展中，環(huán)氧合酶－2(cyclooxygenase－2，COX－2)與腫瘤細胞的增殖、凋亡關(guān)系密切［1－2］，但這些研究多在原發(fā)灶或細胞系中進行，而對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中COX－2的表達與腫瘤細胞增殖、凋亡的關(guān)系尚不明確。由于腫瘤演進過程中在多個方面出現(xiàn)異質(zhì)性變化，研究轉(zhuǎn)移/殘留病灶中COX－2的表達與增殖和凋亡相關(guān)因子的表達，對針對轉(zhuǎn)移和(或)殘留病灶為目標的治療更具臨床意義。故本研究對胃癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中COX－2的表達及其與生存素 (Survivin)、細胞核增殖抗原 (Ki－67)表達的關(guān)系進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年10月—2009年8月在我院手術(shù)并經(jīng)病理證實伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌40例，其中男22例，女18例;年齡45～77歲，平均 (62.9±10.0)歲。患者術(shù)前均未接受放化療。每例腫瘤原發(fā)灶、相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶標本均經(jīng)中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，經(jīng)蘇木精－伊紅染色行病理診斷。

1.2 方法 采用免疫組化染色法 (SP法)分別對腫瘤原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶進行COX－2、Survivin、Ki－67染色，染色步驟嚴格按試劑盒說明書進行操作。用PBS代替一抗做陰性對照，用已知陽性切片做陽性對照。鼠抗人COX－2及Survivin、Ki－67單克隆抗體及免疫組化試劑盒均購自北京中杉生物公司 (美國ZYMED公司產(chǎn)品)。

1.3 結(jié)果判斷 由兩位病理醫(yī)師分別雙盲閱片進行結(jié)果判斷。每張切片隨機取10個高倍視野 (×400)，每視野計數(shù)100個細胞，COX－2、Survivin以細胞膜和 (或)細胞質(zhì)著染呈黃色為染色陽性，Ki－67以細胞核著染呈黃色為染色陽性。按腫瘤細胞著色強度和陽性細胞率分別進行記分;細胞增殖水平以Ki－67標記指數(shù) (labeling index，LI)表示［3］。著色強度記分:無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。腫瘤細胞陽性細胞率記分標準:陽性細胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，≥76%為4分。兩種記分標準所得分值的乘積為0或1表示陰性 (－)，2～3為弱陽性 (+)，4～7為陽性 (++)，≥8為強陽性 (+++)。表達強度標準:記分≤3為弱表達，≥4為強表達。Ki－67 LI為計算出每張切片上的陽性表達百分數(shù)，即為Ki－67標記指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SAS8.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計檢驗。計數(shù)資料采用McNemar'sχ2檢驗，計量資料采用t檢驗，各指標間表達的相關(guān)性采用雙變量相關(guān)分析。p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、原發(fā)灶間COX－2、Survivin、Ki－67表達強度比較 COX－2、Survivin在原發(fā)灶中強表達率分別為52.5%(21/40)、70.0%(28/40);在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中強表達率分別為72.5%(29/40)、72.5%(29/40)。經(jīng)Mc-Nemar'sχ2檢驗，COX－2在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達顯著高于原發(fā)灶，差異有統(tǒng)計學意義 (χ2=4，P=0.046);Survivin在兩種病灶中的表達強度比較差異無統(tǒng)計學意義 (χ2=0.0667，P=0.796，見表1)。原發(fā)灶中Ki－67 LI(58.9±22.4)顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶 (50.6±20.8)，差異有統(tǒng)計學意義 (t=－2.17，P=0.04)。

雙變量相關(guān)分析顯示，原發(fā)灶中COX－2的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中COX－2的表達呈正相關(guān) (r=0.3484，P=0.0276);Ki－67 LI在兩種組織中的表達亦呈正相關(guān) (r=0.5817，p＜0.0001);但兩種組織中Survivin的表達則無明顯相關(guān)性 (r=0.1816，P=0.262)。

2.2 原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中COX－2表達與Survivin、Ki－67的關(guān)系 在原發(fā)灶中，COX－2的表達與Survivin、Ki－67的表達呈正相關(guān) (r值分別為 0.6954和0.6084，P均 ＜0.0001);Survivin與Ki－67的表達也呈正相關(guān) (r=0.6402，p＜0.0001)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，COX－2的表達與Ki－67的表達呈正相關(guān) (r=0.3350，P=0.035)，但COX－2與 Survivin、Survivin與Ki－67均無相關(guān)性 (r=0.2993，P=0.061;r= －0.0298，P=0.855)。

表1 COX－2、Survivin在胃癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達 (例)Table 1 The expression of COX－2，Survivin in primary tumor and lymph node metastases of gastric carcinoma

3 討論

胃癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等生物學行為均與細胞增殖和凋亡失調(diào)密切相關(guān)。環(huán)氧合酶 (cyclooxygenase，COX)是一種膜結(jié)合蛋白，有COX－1和COX－2兩個亞型，而COX－2與腫瘤的發(fā)生、侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系已得到部分證實［4］。Krysan等［5］研究發(fā)現(xiàn)，特異性的COX－2抑制劑能明顯減少Survivin的表達、腫瘤細胞凋亡增多;其他相關(guān)研究也證實COX－2表達與腫瘤細胞的增殖和凋亡有關(guān)［1，5］。本研究結(jié)果顯示，COX－2在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達與原發(fā)灶中的表達呈正相關(guān)，提示COX－2可能在胃癌的轉(zhuǎn)移過程中起作用;同時COX－2在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達強度顯著高于原發(fā)灶，表明胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中COX－2的表達已發(fā)生了異質(zhì)性變化。由于腫瘤切除后復(fù)發(fā)的根源是殘留和 (或)轉(zhuǎn)移灶［6］，進展期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高達60%～80%，已成為影響預(yù)后的獨立因素，故研究淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中COX－2的表達具有重要意義。

Survivin可通過抑制Caspase阻止細胞凋亡，是目前已知分子量最小的凋亡抑制蛋白［7］，有強大的凋亡抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Survivin在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達強度與原發(fā)灶中的表達強度既無顯著差異，也無相關(guān)性，提示Survivin在原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶胃癌細胞的凋亡抵抗中發(fā)揮重要作用，可能成為胃癌生物治療的新靶點;同時結(jié)果也提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中Survivin的表達多發(fā)生了異質(zhì)性變化，以原發(fā)灶中Survivin表達情況預(yù)測轉(zhuǎn)移灶中的表達是不準確的。分析COX－2與Survivin的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，原發(fā)灶中COX－2與Survivin的表達呈正相關(guān)，而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中COX－2則與Survivin的表達則失去了這種關(guān)系。這說明COX－2可通過調(diào)控Survivin的表達抑制腫瘤細胞的凋亡;同時也表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶相比，諸多基因、大分子事件的異質(zhì)性變化過程更為復(fù)雜，COX－2并非調(diào)控胃癌Survivin蛋白表達和功能的惟一因素，這一過程是多種與凋亡相關(guān)的基因/蛋白共同參與而實現(xiàn)的［8］。

Ki－67是反映細胞增殖的因子，是目前應(yīng)用最廣泛、能準確反映增殖活性的指標［9－10］。本研究結(jié)果顯示，胃癌原發(fā)灶中Ki－67 LI顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，說明胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細胞增殖活性低于原發(fā)灶，提示胃癌轉(zhuǎn)移過程中腫瘤的增殖活性與原發(fā)灶不同;結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，兩種組織的Ki－67表達強度呈正相關(guān)，說明腫瘤轉(zhuǎn)移過程中Ki－67的變化可能存在一定規(guī)律性，但這種變化的具體情況及意義尚待繼續(xù)研究。Schmitz等［11］研究發(fā)現(xiàn)COX－2與腫瘤細胞的增殖有密切關(guān)系，本研究也發(fā)現(xiàn)COX－2與Ki－67在胃癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中均表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性，說明COX－2確與腫瘤細胞增殖有關(guān)，COX－2可能通過調(diào)控Ki－67來影響胃癌細胞的增殖活性。

本研究初步證實COX－2在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達與原發(fā)灶比較，已經(jīng)出現(xiàn)異質(zhì)性變化，且COX－2可能通過影響Survivin和Ki－67的表達來參與胃癌細胞的增殖、凋亡過程，故檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中COX－2的表達對研究胃癌轉(zhuǎn)移過程中腫瘤細胞增殖、凋亡的變化有一定價值，但具體調(diào)控機制尚待進一步研究。

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