王 強，由振東，石雪銀，王成才*

(1第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院，上海 200003;2第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室)

認(rèn)知功能障礙是由多因素引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，異氟醚等吸入麻醉藥為其重要發(fā)病原因之一，但作用機制尚不明確。2010年 3月，我們觀察了 p38細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶通路(MAPK)抑制劑 SB203580對異氟醚誘發(fā)新生大鼠學(xué)習(xí)與記憶功能損害的影響，旨在為進一步異氟醚導(dǎo)致新生大鼠認(rèn)知功能障礙的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 7日齡新生 SD大鼠 60只(第二軍醫(yī)大學(xué))雌雄不限;p38MAPK抑制劑 SB203580(碧云天生物技術(shù)研究所)，雙喹啉-4-羧酸二鈉(BCA)蛋白質(zhì)定量試劑盒;聚丙烯酰胺(PAGE)，雙丙烯酰胺，十二烷基硫酸鈉(SDS)，焦碳酸二乙酯(DEPC)，Tris堿，甘氨酸，甲醇等。

1.2 動物分組及處理 將 60只新生 SD大鼠隨機分為 5組各 12只。其中A組正常飼養(yǎng);B、C組均置于自制麻醉氣體吸入箱中并分別吸入 1.2%、1.8%異氟醚，D、E組處理分別同 B、C組，但在吸入異氟醚前 30 min腹腔注射 SB203580(5μg/kg)，四組麻醉期間均正常飼養(yǎng)并經(jīng)腹腔補充葡萄糖生理鹽水0.5 ml/次、1次/2 h。 6周后進行下述實驗。

1.3 行為學(xué)實驗(Morris水迷宮實驗) ①定位航行試驗:歷時 5 d，將大鼠從四個入水點面向池壁放入水中，其 2 min內(nèi)尋找平臺的時間為逃逸潛伏期(T1);②空間探索試驗:定位航行實驗結(jié)束后，于第6天移除平臺位置，將大鼠任選一入水點放入水中，30 s內(nèi)在原平臺所在象限停留時間為探索時間(T2)。整個認(rèn)知功能測試過程中，保持實驗室內(nèi)燈光、物品擺放等室內(nèi)環(huán)境一致，以排除環(huán)境干擾。實驗步驟參照 Vorhees等[1]研究。

1.4 海馬區(qū) p38蛋白含量測定 Morris水迷宮實驗后 24 h內(nèi)處死大鼠取海馬組織，采用Western blot法測定 p38蛋白含量:①在海馬組織中加入預(yù)冷的蛋白質(zhì)抽提試劑，用勻漿器 30 s/次低速勻漿，每次勻漿間隔冰浴 1 min，至組織完全裂解。②按 50∶150比例混合 BCA試劑 A和 BCA試劑 B以配制BCA工作液。③SDS-PAGE電泳:將配制好的 BCA工作液緩慢加入到裝配板中至凝膠高度為 6 cm左右，預(yù)留 1.5 cm高度配制積層膠。每板凝膠溶液上覆蓋 0.1%SDS，放置 1 h后使用濾紙吸去分離膠上層覆蓋的所有溶液，加入電泳緩沖液、上樣，使用BioRad電泳。④取上述凝膠用 1×轉(zhuǎn)移緩沖液稍微清洗，采用 Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置夾板于 100 V恒壓、4℃條件下轉(zhuǎn)移。⑤在5%BSA溶液中室溫孵育1 h，TBS/T洗膜 3次、每次 5 min，加入一級抗體 4℃過夜，同前洗膜 3次后加入 HRP標(biāo)記的二級抗體，室溫孵育膜 1 h，同前洗膜 3次。⑥將膜置于反應(yīng)液中室溫孵育 5 min，去除過量溶液后夾在兩塑料薄膜間，以 X光膠片曝光。圖片掃描保存，軟件分析特異條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。采用重復(fù)測量及方差分析，計量資料以±s表示，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)實驗 五組不同時間點 T1見表1;T2在 A組為 (12.04±5.493 6)s、B組為(9.581±4.258 6)s、C組為 (8.675±3.671)s、D組為(11.825±4.288 8)s、E組為(10.467±5.095 6)s，B、C組均顯著短于 A組，D、E組分別顯著長于 B、C組(P均 ＜0.05)。

2.2 五組大鼠海馬區(qū) p38蛋白含量 A組為 380.37±8.08、B組為 491.44±2.51、C組為 681.79±16.82、D組為 404.57±2.87、E組為 573.20±13.73，B、C組均顯著高于 A組(P均 ＜0.05)，D、E組分別顯著低于 B、C組(P均 ＜0.05)。

表1 五組不同時間點 T 1比較(s，n=12，±s)

表1 五組不同時間點 T 1比較(s，n=12，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;與 B組比較，△P＜0.05;與 C組比較，#P＜0.05

組別 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d A組 62.78±19.51 33.02±14.55 27.85±12.90 18.41±11.03 16.65± 6.14 B組 67.55±23.29 39.14±30.53 33.67±17.02 26.83±32.09 21.17±10.43*C組 75.86±26.98 56.98±28.38 38.34±16.06 28.32±19.78 25.91±23.32*D組 66.48±21.34 34.97±12.53 28.11±14.86 20.20±9.14 17.65± 6.34△E組 67.41±29.96 35.80±26.76 33.20±17.00 23.25±11.02 19.47±12.82#

3 討論

認(rèn)知功能障礙在流行病學(xué)、病因?qū)W、發(fā)病機制、預(yù)防和治療等方面均存在眾多未知領(lǐng)域。手術(shù)和麻醉并發(fā)癥對其有促進作用[2]。研究認(rèn)知功能障礙主要是從學(xué)習(xí)與記憶功能損傷方面進行。異氟醚為目前臨床常用吸入麻醉藥之一，用途廣泛。研究表明，異氟醚可誘發(fā)新生大鼠認(rèn)知功能障礙，并對其成年后的學(xué)習(xí)與記憶功能仍有影響[3]，但具體機制仍有諸多不明之處。出生后第 7天是大鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的一個瓶頸期，此時其神經(jīng)系統(tǒng)極易受損傷，故本研究選擇 7日齡大鼠進行異氟醚處理;按標(biāo)準(zhǔn)夾尾法測定的大鼠異氟醚最低肺泡有效濃度(MAC)值約為 1.8%和 1.2%[4]，故本研究異氟醚深度分別選擇 1.8%和 1.2%。

p38MAPK通路是細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)信號通路，在許多疾病發(fā)病過程中具有重要作用。許多研究表明，激活海馬 p38MAPK通路可導(dǎo)致學(xué)習(xí)與記憶功能受損[5，6]，而抑制海馬 p38MAPK通路活化可減輕學(xué)習(xí)與記憶功能損傷;p38MAPK通路可被應(yīng)激刺激(Uv、H2O2、熱休克和缺氧等)、炎性因子 (TNF-α、IL-1和成纖維細(xì)胞生長因子等)及脂多糖(LPS)和革蘭陽性細(xì)菌細(xì)胞壁成分而激活[7，8]，本研究顯示，B、C組T1均顯著長于 A組，而 D、E組分別顯著短于 B、C組;B、C組 T2均顯著短于 A組，而 D、E組分別顯著長于 B、C組;B、C組海馬區(qū) p38蛋白含量顯著高于 A組，而 D、E組分別顯著低于 B、C組。提示異氟醚可誘發(fā)新生大鼠學(xué)習(xí)與記憶功能受損，p38MAPK抑制劑 SB203580則可明顯減輕其受損程度。故通過誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)激活p38MAPK通路可能為異氟醚誘發(fā)新生大鼠認(rèn)知功能障礙的途徑之一。

綜上所述，異氟醚誘發(fā)新生大鼠認(rèn)知功能障礙與 p38MAPK通路活化具有密切關(guān)系，抑制該通路活化可減輕認(rèn)知功能損害。

[1]Vorhees CV，Williams MT.Morris water maze:procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory[J].Nat Protoc，2006，1(2):848-858.

[2]Hanning CD.Postoperative cognitive dysfunction[J].Brit J Anaesth，2005，1(95):82-87.

[3]Jevtovic TV，Hartman RE，Izumi Y，et al.Early exposure to comman anesthetic agents carsese widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persisted learning deficts[J].J Neurosci，2003，23(3):876-882.

[4]Johns RA，Moscicki JC，Difazio CA.Nitric oxide synthase inhibitor dose-dependently and reversibly reduces the threshold for halothane anesthesia[J].Anesthesiology，1992，77(4):779-784.

[5]Togashi H，Mori K，ItohY，et al.Involvement of interleukin-1beta nitric oxide pathway in the postischemic impairment of long-term potentiation of the rat hippocampus[J].Neurosci Lett，2001，313(3):133-136.

[6]Vereker E，Donnell E，Lynch MA.The inhibitory effect of interleukin-1beta on long-term potentiation is coupled with increased activity of stress-activated protein kinases[J].Neurosci，2000，20(18):6811-6819.

[7]Boder AJ，Ye R，Lees-Miller SP.Uv-light induces p38MAPK-dependent phosphorylation of Bel10[J].Biochem Biophys Res Commun，2003，301(4):923-926.

[8]Taro M，Ingela T，Majlis B，et al.p 38MAPK kinase negatively regulatesengothelial cell survival，proliferation，ang differentiation in FGF-2-stimul-ated angiogenesis[J].JCell Biology，2002，156(1):149-160.