周艷芬 ，田景賢 ，倪志華，2，靳 祎，張瑞英，任國棟

(1河北大學生命科學院，河北保定 071002;2河北省生物工程技術研究中心)

彎齒琵甲是我國華北北部和西北東部的優(yōu)勢昆蟲，研究表明[1～4]，該昆蟲的防御性分泌物含有 16種游離氨基酸和 16種蛋白氨基酸，有些氨基酸具有免疫調節(jié)及抗腫瘤作用，但有關彎齒琵甲的抗腫瘤作用鮮見報道。2009年，本實驗觀察了彎齒琵甲含藥血清對宮頸癌 HeLa細胞增殖的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 彎齒琵甲采自河北省張北縣，在河北大學生物化學實驗室飼養(yǎng);健康家兔 12只，體質量1.8～2.0 kg;宮頸癌 HeLa細胞購自河北省腫瘤醫(yī)院科研中心。主要儀器及試劑:四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自 Sigma公司;二甲基亞砜(DMSO)購自 GIBCO公司;RPMI 1640培養(yǎng)基，GIBCO公司產品;新生牛血清，中國杭州四季青生物工程材料有限公司產品;Wright's-Giemsa染液購自 GIBCO公司;吖啶橙(AO)購自惠澤生物公司;溴化乙錠(EB)購自華美生物工程公司;CO2培養(yǎng)箱，日本 Sanyo公司;超凈工作臺，蘇州凈化集團安泰公司制造;倒置顯微鏡，日本 Olympus公司;Bio-Rad Model m680酶標儀，美國 Gene公司。

1.2 方法

1.2.1 彎齒琵甲含藥血清的制備 取干燥的彎齒琵甲 15 g，研磨成粉，溶于 300 ml生理鹽水，8 000 r/min離心 10 min，取上清，分別進行 3、9倍稀釋，濃度依次劃分為 3組:原液組(高劑量組)、3倍稀釋溶液組(中劑量組)、9倍稀釋溶液組(低劑量組)。將12只健康家兔隨機分為 4組，每組 3只。按灌胃給藥濃度不同分為高劑量藥物組、中劑量藥物組、低劑量藥物組、空白組。各組家兔每日早、晚各灌胃給藥1次 ，每次 15 ml，連續(xù) 3 d;末次給藥 1 h后乙醚麻醉，取頸動脈血 10 ml，注入無菌管中，4℃冰箱靜置6 h，吸出上清液，2 000 r/min離心 10 min，取上清液置 56℃水浴中滅活 30 min，0.22μm的微孔濾膜過濾，即為含藥血清。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 宮頸癌 HeLa細胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)液、5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.3 宮頸癌 HeLa細胞增殖抑制率的檢測 采用 MTT法。取對數(shù)生長期細胞消化，調整細胞密度至 2.5×104/ml，接種于 96孔板，培養(yǎng)基量為 1.8×10-4L/孔 (細胞量約 3 ×104/孔 )，5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待細胞貼壁后，吸出舊的培養(yǎng)基，將高、中、低 3個劑量的含藥血清分別配制成含血清量 10%、20%的培養(yǎng)基，加入 96孔板，陰性對照組用等體積的空白組血清培養(yǎng)基，每個濃度設 5個平行孔，分別繼續(xù)培養(yǎng) 24、48 h。培養(yǎng)結束后，每孔分別加入 2×10-5L MTT(終濃度為 0.5 g/L)，孵育 4 h，棄上清 ，加入 DMSO 1.5×10-4L，震蕩器輕微震蕩 10 min，于酶標儀 570 nm處測定各孔的吸光度(OD570值)，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率 =(1-實驗組 OD570/對照組 OD570)×100%。

1.2.4 宮頸癌 HeLa細胞形態(tài)學觀察 ①Wright's-Giemsa染色:在 24孔板中加入 5×10-4L細胞懸液(1×105/孔)，待細胞在 24孔培養(yǎng)板中貼壁后，吸棄培養(yǎng)基，加入 5×10-4L彎齒琵甲含藥血清培養(yǎng)基，陰性對照加入空白組血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，棄上清，用 PBS洗滌 3次，95%的乙醇進行固定 10 min，按試劑盒操作 Wright's-Giemsa染色 20 min，PBS沖洗 3次，倒置顯微鏡下觀察并拍照。②AO-EB染色:細胞處理同上，加入 8×10-6L AO-EB染色液(0.2 g/L的吖啶橙和 0.2 g/L溴化乙啶各 4×10-6L)染色 10 min，棄去染液 ，PBS沖洗 3次，加入封片劑(甘油∶PBS=1∶1)，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 凋亡細胞生化特征檢測 取對數(shù)生長期的腫瘤細胞用 0.25%胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，調整細胞密度為 1×108/L，接種于 25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于 5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁后吸棄培養(yǎng)液，實驗組分別加入 20%不同劑量彎齒琵甲含藥血清培養(yǎng)基(高劑量、中劑量和低劑量)，培養(yǎng) 48 h后，按動物細胞 DNA提取試劑盒操作提取其 DNA，并進行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，75 mA恒流 1.5～2.0 h。電泳完畢，在凝膠成像分析儀內掃描、觀察、拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件，結果以±s表示，數(shù)據(jù)處理采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 彎齒琵甲含藥血清對宮頸癌 HeLa細胞的抑制作用 見表1。

表1 彎齒琵甲含藥血清對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響

2.2 彎齒琵甲含藥血清對 HeLa細胞形態(tài)學的影響 彎齒琵甲含藥血清處理宮頸癌 HeLa細胞 48 h后，Wright's-Giemsa染色法在倒置顯微鏡下顯示，宮頸癌 HeLa細胞部分出現(xiàn)細胞膜皺縮，細胞核固縮，核染色質邊緣化，核膜裂解，細胞膜周圍或細胞外出現(xiàn)凋亡小體，并隨著劑量的增加細胞凋亡數(shù)量也增加，表明彎齒琵甲含藥血清能夠誘導 HeLa細胞凋亡;陰性對照組 HeLa細胞的細胞膜完整，核仁及染色質分布在細胞核中。AO-EB染色熒光顯微鏡下顯示，正常活細胞核染色質呈均勻綠色，細胞形態(tài)正常，早期凋亡的細胞呈黃綠色球狀，晚期凋亡細胞呈橙紅色球狀，進一步表明彎齒琵甲含藥血清能夠誘導宮頸癌 HeLa細胞凋亡。

2.3 凋亡細胞 DNA片段的檢測 瓊脂糖凝膠電泳顯示，3、4、5泳道均可見 DNA梯形狀，說明彎齒琵甲含藥血清是通過誘導細胞凋亡來抑制 HeLa細胞的增殖作用。見圖1。

圖3 HeLa細胞經不同劑量琵甲含藥血清作用后DNA片段分析

3 討論

血清藥理學是日本學者 Hiroko Iwama于 1984年在第一屆和漢醫(yī)藥學會上首次提出的[5]，是指將中藥或中藥復方經口給動物灌服一定時間后采集動物血液，分離血清，用含有藥物成分的血清進行體外實驗的一種研究方法。該研究法被廣泛用于中藥的藥理及藥效學的研究中，能較為客觀真實地闡明中藥的藥效和作用機制[6]。彎齒琵甲的勻漿液含有蛋白質、脂肪、多糖、微量元素、防御液等多種成分，如果將其粗制品直接加入體外培養(yǎng)細胞系中，往往由于粗制品中含有較多的雜質、p H值、滲透壓等影響實驗結果，而且該粗制品多數(shù)通過口服經體內代謝發(fā)揮直接或間接的治療效果，與體外實驗結果常常不一致。因此，本實驗采用含藥血清用于體外實驗更能反映粗制品的體內效應，客觀地模擬了藥物與機體相互作用的過程，所獲實驗結果與體內實驗有較好的一致性，為從細胞、亞細胞和基因水平研究中藥的抗癌機制提供了一個更加科學、客觀的研究手段。

為了探討彎齒琵甲抗腫瘤的作用機制，本實驗首先將制備的含藥血清按 10%、20%的濃度添加到無血清培養(yǎng)基中，采用 MTT法檢測不同劑量的彎齒琵甲含藥血清作用于 HeLa細胞 24、48 h后，抑制作用明顯，且呈量效、時效關系。Wright's-Giemsa染色可以清晰地看到凋亡細胞的形態(tài)變化，細胞變圓，晚期凋亡細胞出現(xiàn)凋亡小體。熒光顯微鏡下觀察AO-EB染色，可以看到早期凋亡細胞呈黃綠色球狀，晚期凋亡細胞呈橙紅色。這些結果初步表明彎齒琵甲含藥血清通過誘導細胞凋亡作用發(fā)揮抗腫瘤作用。

細胞凋亡是細胞在特定信號誘導下的主動程序性死亡，凋亡過程會發(fā)生多種生化特征的改變，如蛋白降解、蛋白偶聯(lián)、DNA裂解以及吞噬細胞識別，凋亡晚期的主要生化特征是染色質發(fā)生濃縮，染色質DNA被 Ca2+和 Mg2+依賴的核酸內切酶降解成 180～200 bp的寡核苷酸片段[7，8]，在凝膠電泳上表現(xiàn)為 DNA梯形狀。本實驗選用 20%高、中、低劑量彎齒琵甲含藥血清培養(yǎng)基分別作用于 HeLa細胞 48 h后，細胞不同程度地出現(xiàn)了梯狀條帶，進一步說明彎齒琵甲含藥血清能夠誘導 HeLa細胞的凋亡作用。

綜上所述，我們認為彎齒琵甲含藥血清對宮頸癌 HeLa細胞的增殖具有抑制作用，且呈量效和時效關系，為宮頸癌的治療提供了新的藥源，為彎齒琵甲的進一步開發(fā)利用奠定了理論基礎，但具體發(fā)揮作用的中藥成分及其是否影響相關基因的表達，以及對其他癌細胞是否有相同功效還有待于進一步研究。

致謝:感謝河北農業(yè)大學朱寶成教授在實驗過程中提供的幫助。

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