李晨光，羅俊生，馮 旭，霍小川，關 寧

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121001)

動脈粥樣硬化(AS)是一個復雜的病理過程，巨噬細胞源性泡沫細胞的形成是其顯著特征[1]。清道夫受體介導的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的蓄積是 AS發(fā)生、發(fā)展中泡沫細胞形成的關鍵[2]。研究表明，他汀類藥物除具有顯著的降脂作用外，還具有獨特的心血管防治作用，如改善內(nèi)皮細胞功能、抗炎、抑制 LDL的氧化修飾、抑制清道夫受體表達等[3]。然而關于他汀類藥物對清道夫受體介導的THP-1巨噬細胞脂質(zhì)蓄積的影響及機制仍不甚明確。2010年 6～12月，我們觀察了不同濃度辛伐他汀對人單核源性巨噬細胞泡沫化的影響，并對此類藥物的抗 AS機理進行了初步探討?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 THP-1單核巨噬細胞株(中國科學院上海細胞生物學研究所)，胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國 GIBCO公司)，ox-LDL(北京協(xié)生生物科技有限公司)，油紅 O和佛波酯(PMA)(Sigma公司);淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物公司)，辛伐他汀(輝瑞制藥)，BCA蛋白含量測定試劑(北京 Applygen基因技術有限公司);SR-A羊抗人和 β-actin兔抗人一抗，辣根過氧化物酶標記驢抗羊和羊抗兔二抗(Santa Cruz公司)。其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)及實驗分組 THP-1細胞生長于含 10%滅活新生胎牛血清、1×108U/L青霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，置 37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每次實驗前用 150 nmol/L PMA孵育 24 h，使其誘導分化為巨噬細胞。在每次實驗前將巨噬細胞密度調(diào)整為 1×106個 /孔，加入 6孔培養(yǎng)板中。實驗細胞分為 5組，即對照組、ox-LDL組、辛伐他汀按濃度分低中高 3組(1、10、100μmol/L組)。ox-LDL組加入 ox-LDL(終濃度為 100 mg/L)處理 24 h;辛伐他汀處理組按不同濃度辛伐他汀處理巨噬細胞 2 h后，加入 ox-LDL(終濃度為 100 mg/L)處理 24 h，誘導巨噬細胞泡沫化;對照組不予處理。

1.2.2 SR-A蛋白的檢測 采用 Western blot法。上述各組細胞經(jīng) 24 h處理后用細胞刮刀收集至 EP管內(nèi)。用 TBS漂洗后加入 RIPA緩沖液(1%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、1%SDS、0.1%PMSF)裂解細胞，考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度。加熱變性，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入 1∶200 SR-A羊抗人一抗，雜交 2 h。TBST洗膜后加入 1∶15 000驢抗羊二抗 ，溫育 1 h，TBST洗膜后進行 BCIP/NBT顯色，采用 Chemi-genius凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的表達量。人 β-actin作為內(nèi)參，一抗是 1∶500兔抗人 β-actin抗體，二抗是1∶15 000羊抗兔二抗。

1.2.3 油紅 O染色和脂質(zhì)染色的半定量分析 將貼壁的巨噬細胞以 PBS沖冼3次，放在 4℃、10%甲醛中固定 10 min，用油紅 O染色、水冼 5 min，60%異丙醇中放置 5 min，新過濾的油紅 O染色 10 min，60%異丙醇分化 5 min，水洗 5 min，Mayer氏苯木精明礬染液染色 5 min，1%HCl分色及反藍后，水洗 5 min并照相。按 Wada方法[4]進行脂質(zhì)染色的半定量分析，即根據(jù)細胞脂滴的面積進行細胞分類。如果細胞脂滴的面積小于細胞核的面積記為“-”，細胞脂滴的面積等于或大于細胞核的面積記為“+”，此即為油紅 O染色細胞，每孔隨機計數(shù)一個視野(×400)的細胞。

1.2.4 高效液相色譜分析(HPLC) 待細胞處理結束后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗 3遍，加入 1 ml生理鹽水重新稀釋細胞，反復凍融，冰浴中超聲裂解細胞。高效液相色譜法參照 Cullen等[5，6]的方法，測定細胞游離膽固醇(FC)和膽固醇酯(CE)的含量。膽固醇用外標法峰面積定性定量。色譜條件為色譜柱:C18;流動相 ∶異丙醇 ∶正庚烷 ∶乙腈 (35∶12∶52，v/v)，非梯度洗脫;流速:1 ml/min;檢測波長:210 nm，檢測到第 8分鐘;柱溫:20℃。用 CE酶水解 CE得TC量，以 HPLC測定膽固醇并定量，以 TC量減去FC量代表CE量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件，結果以±s表示，兩組間比較采用 t檢驗及方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組油紅 O染色陽性細胞變化 ox-LDL誘導24 h后，油紅 O染色結果顯示:正常對照組細胞形態(tài)呈橢圓形或不規(guī)則形狀，油紅 O染色陽性細胞少，細胞核藍染，胞質(zhì)略顯紅色;ox-LDL誘導組陽性細胞遍布，胞質(zhì)大量紅染，細胞核藍染，且細胞體積部分增大，細胞呈圓形或不規(guī)則形。通過比較陽性細胞數(shù)量可以看出，陽性細胞率由(8.65±1.40)%增加到(86.70±0.89)%;HPLC檢測結果顯示:ox-LDL誘導組的 CE與 TC之比大于 60%。以上結果說明巨噬細胞泡沫化效果明顯。見表1。

表1 不同濃度辛伐他汀處理后巨噬細胞油紅 O染色陽性細胞的相對含量(%，±s)

表1 不同濃度辛伐他汀處理后巨噬細胞油紅 O染色陽性細胞的相對含量(%，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與 ox-LDL組比較，#P＜0.01

組別 n 陽性細胞率對照組 5 8.65±1.40 ox-LDL組 5 86.70±0.89*ox-LDL組 +低劑量辛伐他汀組 5 75.34±0.46#ox-LDL組 +中劑量辛伐他汀組 5 45.68±1.35#ox-LDL組 +高劑量辛伐他汀組 5 14.21±2.12#

2.2 辛伐他汀處理后細胞內(nèi) CE變化的量效關系辛伐他汀處理后，油紅 O染色陽性細胞比例明顯減少。當藥物濃度在 100μmol/L時，陽性細胞比例接近正常細胞。HPLC檢測結果顯示，CE/TC值隨著辛伐他汀濃度的增加而降低，由(64.34±0.86)%降至(24.21±1.16)%(P＜0.01)，說明辛伐他汀預處理細胞可以減少 CE在細胞內(nèi)聚集，有效抑制細胞泡沫化。見表2。

表2 不同濃度辛伐他汀處理后細胞中CE/TC的變化(%，±s)

表2 不同濃度辛伐他汀處理后細胞中CE/TC的變化(%，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與 ox-LDL組比較，#P＜0.01

組別 n CE/TC變化對照組 5 19.23±0.95 ox-LDL組 5 64.34±0.86*ox-LDL組 +低劑量辛伐他汀組 5 57.21±0.57#ox-LDL組 +中劑量辛伐他汀組 5 46.83±0.64#ox-LDL組 +高劑量辛伐他汀組 5 24.21±1.16#

2.3 細胞 SR-A蛋白表達的情況 通過 Western blot檢測顯示，對照組細胞中 SR-A蛋白表達量較少(0.82±0.23)，當巨噬細胞經(jīng) ox-LDL誘導分化成泡沫細胞過程中，SR-A蛋白水平(1.96±0.42)顯著上調(diào)(P＜0.01)。經(jīng)辛伐他汀處理后，SR-A蛋白的表達量值隨著辛伐他汀濃度的增加而降低，當濃度降到 100μmol/L，SR-A蛋白表達水平(0.79±0.12)接近正常巨噬細胞。見圖1。

圖1 SR-A蛋白表達量

3 討論

巨噬細胞源性泡沫細胞的形成是一個多環(huán)節(jié)的復雜過程。一方面，巨噬細胞對 LDL起修飾作用。巨噬細胞通過細胞內(nèi)多種酶(如脂肪氧化酶)和活性氧(如超氧負離子)作用于 LDL而產(chǎn)生一定程度的氧化修飾。巨噬細胞大量吞噬被自身細胞核金屬離子修飾的 LDL，表現(xiàn)出一定的泡沫化傾向[7，8]。另一方面，巨噬細胞通過清道夫受體，CD36受體或其他受體的作用，對 ox-LDL的大量吞噬促成了巨噬細胞源性泡沫細胞的形成[9]。本實驗用 ox-LDL孵育巨噬細胞，當終濃度為 100 mg/L時，泡沫化效果較好，泡沫化率接近 90%。

SR-A是一種跨膜糖蛋白受體，主要表達于巨噬細胞、血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞，ox-LDL作為一種重要的配體與之結合后，在 AS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。巨噬細胞吞噬脂質(zhì)轉變?yōu)榕菽毎窃缙?AS形成過程中的關鍵環(huán)節(jié)，SR-A是巨噬細胞膜上的糖蛋白，其不受細胞內(nèi)膽固醇的負反饋調(diào)節(jié)，能無限制地吸收細胞外的脂質(zhì)進入細胞內(nèi)，使巨噬細胞轉變?yōu)榕菽毎鸞10]。本研究顯示，在 ox-LDL刺激巨噬細胞 24 h后形成的泡沫細胞中，SR-A蛋白表達含量增加，提示 ox-LDL對 SR-A受體表達的影響可能是通過增強 SR-A基因轉錄實現(xiàn)的，即通過促進受體表達量來增強對其自身的結合和攝取。

他汀類藥物是目前臨床上應用最為廣泛的調(diào)脂藥物，既可以降低血低密度脂蛋白膽固醇水平，也可以明顯減少冠狀動脈心臟病等心血管疾病的發(fā)病率和死亡率，從而奠定了他汀類藥物在動脈粥樣硬化防治中的重要地位。大量的臨床和基礎研究證實，他汀類藥物的臨床意義除了調(diào)脂作用，還能發(fā)揮多種非膽固醇依賴的直接生物學效應，包括抗炎、改善血管內(nèi)皮細胞功能、抑制平滑肌增殖、穩(wěn)定斑塊等。其中抗炎作用對抑制動脈粥樣硬化的形成、降低心血管事件的發(fā)生率具有重要意義。本實驗采用 ox-LDL處理人 THP-1單核源性巨噬細胞建立泡沫細胞模型，采用不同濃度的辛伐他汀進行干預。結果顯示，辛伐他汀處理泡沫細胞后，油紅 O染色提示細胞內(nèi)脂滴較對照組明顯減少，細胞內(nèi)的 CE顯著減少，CE/TC值隨著辛伐他汀濃度的增加而降低(P＜0.01)，說明辛伐他汀預處理細胞可以減少 CE在細胞內(nèi)聚集，有效抑制細胞泡沫化，且 SR-A蛋白表達量隨辛伐他汀濃度增高而降低。

綜上所述，辛伐他汀的抗 AS作用除已知的調(diào)脂作用外，還與抑制清道夫受體 SR-A表達、降低巨噬細胞攝取膽固醇、抑制巨噬細胞泡沫化有關。

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