馬洪峰，郭星，李曉瑜

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，沈陽(yáng) 110001）

中心體異常及紡錘體檢控點(diǎn)缺陷導(dǎo)致的基因組不穩(wěn)定被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要因素。絲氨酸/蘇氨酸激酶 15（serine/threonine kinase-15，STK15）基因，又稱BTAK或aurora2基因，定位于20q13，基因已克隆，有9個(gè)外顯子，全長(zhǎng)cDNA 1.8 kb，編碼一種（403個(gè)氨基酸，分子量46 kDa）中心體相關(guān)激酶，對(duì)染色體分離和中心體功能都至關(guān)重要；已證實(shí)STK15是一種癌基因，在多種腫瘤中都出現(xiàn)了擴(kuò)增，其mRNA和蛋白過表達(dá)［1］。BUBR1基因定位于15q15區(qū)域，cDNA全長(zhǎng)3 702 bp，含有23個(gè)外顯子和22個(gè)內(nèi)含子，編碼BUBR1蛋白，分子量為120 kDa，由1 050個(gè)氨基酸組成；該蛋白是紡錘體檢控點(diǎn)處的一個(gè)重要功能蛋白，BUBR1的缺陷可引起染色體的不穩(wěn)定［2］。已有文獻(xiàn)報(bào)道喉鱗狀細(xì)胞癌中存在STK15和BUBR1蛋白的異常表達(dá)，而關(guān)于兩者相互作用的研究尚未見報(bào)道。本研究通過免疫組織化學(xué)方法證實(shí)STK15和BUBR1蛋白的表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌具有相關(guān)性，并應(yīng)用免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)探討喉鱗狀細(xì)胞癌中STK15和BUBR1蛋白的相互作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的來源及制備

40例喉癌組織標(biāo)本及癌旁正常組織標(biāo)本均來源于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2006年9月至2009年6月間的住院患者?；颊呔?jīng)病理診斷為喉鱗狀細(xì)胞癌，均為首發(fā)病例，術(shù)前未經(jīng)放療和化療。術(shù)后取一組標(biāo)本固定于4%多聚甲醛中，送交喉癌研究室制成蠟塊。另一組標(biāo)本立即儲(chǔ)存在-70℃冰箱中，待制備冰凍切片。所取標(biāo)本均經(jīng)患者及家屬知情同意。

1.2 試劑及方法

1.2.1 主要試劑：小鼠抗人BUBR1蛋白質(zhì)抗體，山羊抗人STK15蛋白質(zhì)抗體，驢抗鼠IgG-FITC（綠光），兔抗山羊IgG-TRITC（紅光），均購(gòu)于Santa Cruz公司；SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒（小鼠、山羊）、DAB顯色劑，購(gòu)于福州邁新生物公司。

1.2.2 試驗(yàn)方法：免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)STK15和BUBR1蛋白的表達(dá)水平：組織石蠟塊切片，厚度4μm，分別進(jìn)行蘇木精—伊紅染色和SP免疫組織化學(xué)染色。實(shí)驗(yàn)按SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒的指導(dǎo)步驟進(jìn)行，采用檸檬酸高壓煮沸2 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，STK15抗體工作濃度1∶500，BUBR1抗體工作濃度1∶80，以STK15和BUBR1均陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌標(biāo)本做陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗做陰性對(duì)照。免疫熒光共定位試驗(yàn)：取-70℃冰凍標(biāo)本（免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中STK15和BUBR1均陽(yáng)性表達(dá)的喉癌組織標(biāo)本）制作冰凍切片，丙酮-20℃固定，一抗STK15（1∶500）、BUBR1（1∶100）混育，4 ℃過夜。二抗兔抗山羊 IgG-TRITC（1∶100）、驢抗鼠 IgG-FITC（1∶100）37 ℃混育40 min。熒光顯微鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果觀察及判定：與陰性對(duì)照相比，STK15和BUBR1蛋白陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核少量表達(dá)。光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行圖像采集，所得圖像經(jīng)光密度圖像分析儀分析平均光密度，平均光密度值用來量化蛋白表達(dá)的強(qiáng)度，平均光密度值越大蛋白表達(dá)越強(qiáng)。

1.3.2 免疫熒光共定位結(jié)果觀察及判定：選擇免疫組化實(shí)驗(yàn)中STK15和BUBR1蛋白表達(dá)均陽(yáng)性的喉癌組織標(biāo)本進(jìn)行冰凍切片免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)。熒光染色切片在熒光顯微鏡下觀察，熒光染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核少量。STK15蛋白標(biāo)記為紅色熒光，BUBR1蛋白標(biāo)記為綠色熒光。若2種標(biāo)記重疊為黃色熒光，可認(rèn)為2種蛋白共定位，提示可能存在相互作用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用x±s表示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩樣本均數(shù)比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喉癌組織和癌旁正常組織中STK15和BUBR1蛋白的表達(dá)水平

圖1 喉癌和癌旁組織中STK15蛋白和BUBR1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)×400Fig.1 Positive expression of STK15 and BUBR1 in LSCCtissue and paired normal tissue×400

免疫組化結(jié)果表明，喉癌組織和癌旁正常組織中STK15和BUBR1蛋白均可見陽(yáng)性表達(dá)（圖1）。喉癌組織和癌旁正常組織中STK15蛋白平均光密度值分別為（159.2±3.96）×10-3和（156.5±2.24）×10-3（t=3.722，P<0.05），BUBR1蛋白平均光密度值分別為（117.1±1.95）×10-3和（118.6±1.71）×10-3（t=3.464，P<0.05），喉癌組織中STK15蛋白表達(dá)水平高于癌旁正常組織，BUBR1蛋白表達(dá)水平低于癌旁正常組織。

2.2 免疫熒光共定位結(jié)果

喉癌組織中STK15蛋白和BUBR1蛋白均在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中表達(dá)。熒光顯微鏡觀察，紅色熒光為STK15蛋白表達(dá)標(biāo)記，細(xì)胞質(zhì)中熒光亮度較強(qiáng)，細(xì)胞核次之（圖2A）；綠色熒光為BUBR1蛋白表達(dá)標(biāo)記，仍為細(xì)胞質(zhì)中熒光亮度較強(qiáng)，細(xì)胞核次之（圖2B）。熒光照相系統(tǒng)整合重疊后的圖像中，胞質(zhì)和胞核內(nèi)紅、綠2種熒光標(biāo)記重疊為黃色熒光（圖2C），可認(rèn)為STK15和BUBR1蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌中的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中共定位，提示兩者可能存在相互作用。

圖2 喉癌組織中STK15蛋白和BUBR1蛋白的免疫熒光共定位×400Fig.2 Immunofluorescence of STK15 and BUBR1 protein in LSCCtissue×400

3 討論

STK15和BUBR1都在細(xì)胞有絲分裂過程中扮演重要角色。STK15是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與細(xì)胞DNA合成后期/有絲分裂期（G2/M）轉(zhuǎn)換，通過促進(jìn)中心體成熟及微管晶核形成確保雙極紡錘體的形成，從而保持基因組穩(wěn)定［1］。BUBR1是存在于哺乳動(dòng)物中的有絲分裂檢控點(diǎn)基因家族MAD3的同源基因，BUBR1可以通過自身或作為有絲分裂檢查點(diǎn)復(fù)合物的成分抑制泛素聯(lián)接酶—后期促進(jìn)復(fù)合體的活性，激活有絲分裂檢控點(diǎn)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大。近年來的研究表明，在多種惡性腫瘤中存在著STK15基因擴(kuò)增、過表達(dá)及BUBR1 基因表達(dá)下調(diào)［2］。

本研究顯示，喉癌組織中STK15蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05），而BUBR1蛋白表達(dá)水平喉癌組織明顯低于癌旁正常組織（P＜0.05）。提示喉癌中存在STK15蛋白過表達(dá)及BUBR1蛋白表達(dá)下調(diào)，他們可能與喉癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。1998 年 Bischoff等［3］運(yùn)用 Southern blot發(fā)現(xiàn)原位結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中有 STK15 DNA擴(kuò)增，2004年Rojanala等［4］運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)28例胰腺癌標(biāo)本中26例有STK15高水平表達(dá)。Tong等［5］運(yùn)用免疫組織化學(xué)、Western blot發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌中STK15蛋白量明顯高于正常食管黏膜組織。研究提示，STK15過表達(dá)可能有以下幾種原因：（1）STK15基因本身的擴(kuò)增造成mRNA及蛋白質(zhì)增加［6］；（2）STK15蛋白的抑制因子—p53基因突變，導(dǎo)致p53蛋白對(duì)STK15蛋白抑制作用減弱，導(dǎo)致STK15蛋白無論活性還是表達(dá)量均明顯上升［7］。因此，無論什么原因造成STK15在惡性腫瘤中出現(xiàn)的過表達(dá)，均可導(dǎo)致中心體異常擴(kuò)增，引發(fā)染色體在分裂中的多極分配及不穩(wěn)定，進(jìn)而激活癌基因或使抑癌基因失活，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生。已經(jīng)有關(guān)于BUBR1突變引發(fā)腫瘤的報(bào)道，如結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中檢測(cè)到BUB1和 BUBR1的突變［2］。Fang等［8］報(bào)道了 BUBR1 缺陷也導(dǎo)致對(duì)DNA損傷的妥協(xié)反應(yīng)。Futamura等［9］報(bào)道BRCAZ基因在一些乳腺癌家族中具有遺傳易感性，它被BUBR1磷酸化后在體內(nèi)參與有絲分裂檢查點(diǎn)作用。這些發(fā)現(xiàn)表明BUBR1基因可能在人類癌癥中有絲分裂檢查點(diǎn)控制和有絲分裂檢查點(diǎn)修復(fù)中扮演重要角色。

本研究中免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)表明，喉癌組織中STK15蛋白與BUBR1蛋白在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中共定位，提示兩者可能存在相互作用。STK15蛋白與BUBR1蛋白都定位于中心體；這2種蛋白功能失調(diào)都可以導(dǎo)致中心體擴(kuò)增，引起有絲分裂檢控點(diǎn)反應(yīng)途徑障礙；STK15蛋白過表達(dá)和BUBR1蛋白表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化；惡性腫瘤和實(shí)體瘤中經(jīng)常觀測(cè)到G1/S期﹑M期調(diào)節(jié)蛋白的異常［10］。以上均提示STK15蛋白與BUBR1蛋白可能通過某些作用途徑共同調(diào)控有絲分裂檢控點(diǎn)和中心體復(fù)制。Morrow等［11］通過蛋白質(zhì)印跡法﹑時(shí)差顯微成像技術(shù)等方法研究認(rèn)為BUB1和STK15共同維持BUBR1介導(dǎo)的對(duì)泛素聯(lián)接酶—后期促進(jìn)復(fù)合體的抑制作用，但未闡明他們之間的作用機(jī)制。STK15蛋白C端含有具備催化活性的保守區(qū)域，N端包含一激酶特征性區(qū)域稱為Aurora盒，參與激酶與其他蛋白質(zhì)的相互作用及自身活性調(diào)節(jié)［1］；BUBR1蛋白是1個(gè)對(duì)著絲粒張力起反應(yīng)的多結(jié)構(gòu)域蛋白激酶，有文獻(xiàn)報(bào)道［2］使用3步表達(dá)策略獲得了1個(gè)可溶BUBR1結(jié)構(gòu)，表明BUBR1包括1個(gè)KEN盒模體、1個(gè)Mad3樣域、1個(gè)Bub3連接域和1個(gè)激酶域。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)看STK15蛋白N端包含1個(gè)Aurora盒，BUBR1蛋白包含1個(gè)激酶域。這2個(gè)結(jié)構(gòu)都參與激酶與其他蛋白質(zhì)間的相互作用，故STK15蛋白與BUBR1蛋白存在相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。對(duì)于蛋白質(zhì)相互作用的研究，免疫熒光共定位的優(yōu)點(diǎn)是蛋白質(zhì)之間的相互作用發(fā)生在完整的細(xì)胞里，可以反映蛋白質(zhì)在生理狀態(tài)的活動(dòng)。通過熒光能夠觀察到蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的共定位，但免疫熒光共定位存在一定的假陽(yáng)性率，所以還需免疫共沉淀、酵母雙雜交等其他方法進(jìn)一步鑒證其可靠性。本課題研究尚未結(jié)束，我們下一步將繼續(xù)驗(yàn)證該結(jié)論的可靠性及努力探討2種蛋白相互作用的部位及機(jī)制。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)，STK15蛋白高表達(dá)、BUBR1蛋白低表達(dá)可能與喉癌的發(fā)生具有相關(guān)性，且這2種蛋白在胞質(zhì)、胞核中共定位，提示兩者可能存在相互作用，共同誘導(dǎo)喉癌的發(fā)生，但具體的作用部位及作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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