張 萍， 任永申， 鄢 丹， 段慧娟， 李正明， 肖小河*

(1.解放軍中藥研究所解放軍第三0二醫(yī)院，北京 100039;2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 610075;3.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院研究生隊(duì)，北京 100853)

中藥注射劑是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論與現(xiàn)代科學(xué)結(jié) 合的產(chǎn)物，它開辟了中藥新的給藥途徑，提高了中藥治療臨床急重癥的療效，成為中藥現(xiàn)代化成果的代表，其中諸如清開靈注射液、茵梔黃注射液等都以優(yōu)良的療效成為臨床常用品種，并成為醫(yī)院藥品采購(gòu)的重點(diǎn)。近年來，關(guān)于中藥注射劑不良反應(yīng)的事件和報(bào)道卻不斷攀升，給中藥注射劑的進(jìn)一步研發(fā)和應(yīng)用蒙上了一層陰影。2008年報(bào)道的茵梔黃注射液嚴(yán)重不良反應(yīng)事件，直接導(dǎo)致了該批號(hào)注射液的停用，在業(yè)內(nèi)引起了強(qiáng)烈的反響，促發(fā)了人們對(duì)中藥注射劑的質(zhì)量問題和合理用藥的新認(rèn)識(shí)。

茵梔黃注射液是由茵陳、梔子、金銀花、黃芩等藥物組成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱、解毒、抗菌、消炎及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等藥理作用，常用于治療肝膽濕熱、小便黃赤、急慢性肝炎等病癥［1］，其臨床應(yīng)用廣泛且療效顯著［2-3］。然而，其不良反映的發(fā)生已給人們以警示:有必要對(duì)該注射液安全性和穩(wěn)定性進(jìn)行客觀真實(shí)的評(píng)價(jià)。

為進(jìn)一步提高茵梔黃注射液的臨床應(yīng)用價(jià)值，我們從質(zhì)量一致性和穩(wěn)定性出發(fā)，針對(duì)該注射液的抗菌作用，采用微量量熱法［4-6］考察了7批石家莊神威藥業(yè)生產(chǎn)的茵梔黃注射液對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝的影響，以細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝曲線和定量熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)為指標(biāo)，結(jié)合主成分分析和聚類分析，比較和分析了7批注射液的抗菌作用和質(zhì)量差異，為該注射液安全性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)提供了方法和模式參考。

1 儀器與方法

1.1 儀器 采用瑞典Thermometric公司產(chǎn)的3114/3236型TAM Air Isothermal Calorimeter微量量熱儀測(cè)定金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)熱譜曲線。該熱活性檢測(cè)儀配置Pico TC-80數(shù)據(jù)采集和分析軟件，可同時(shí)獨(dú)立測(cè)定8個(gè)樣品。其熱穩(wěn)定性好，熱功率檢測(cè)限低，且基線穩(wěn)定。其它有關(guān)儀器結(jié)構(gòu)原理及操作詳見文獻(xiàn)［7］。

1.2 材料 菌株:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)CMCC(B)26 003，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。培養(yǎng)基:LB液體培養(yǎng)基，取NaCl 10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，溶解于1 000 mL去離子水中，調(diào)pH7.0～7.2后分裝。121℃高壓蒸氣滅菌30 min，冷卻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品 石家莊神威藥業(yè)(SW)生產(chǎn)的茵梔黃注射液合格樣品共7批，其生產(chǎn)批號(hào)及規(guī)格詳見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Sample information of Yinzhihuang Injection

1.4 方法 采用安瓿法，在無菌條件下，向參比池各20 mL安瓿瓶?jī)?nèi)分別加入10 mL已滅菌去離子水作為參比。反應(yīng)池各安瓿瓶中精確加入10 mL LB培養(yǎng)基(其中已接種1.0×106CFU/mL的金黃色葡萄球菌)，然后分別加入100 μL(1%，v/v)各批茵梔黃注射液，加蓋瓶塞密封，放入微量量熱儀中跟蹤記錄金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝熱譜曲線(Power-time，P-t曲線)，系統(tǒng)控溫于37℃，上述均為無菌操作。當(dāng)曲線重新返回基線時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)熱功率輸出曲線

37℃下，安瓿法測(cè)定了100 μL(1%，v/v)各批次茵梔黃注射液作用下金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)代謝曲線，見圖1。

圖1 茵梔黃注射液樣品作用于金黃色葡萄球菌的熱功率-時(shí)間曲線Fig.1 The power-time curve of S.aureus affected by Yinzhihuang Injection

結(jié)合Kong等［8］報(bào)道，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)代謝曲線可以劃分為5個(gè)生長(zhǎng)期:停滯期、第一指數(shù)生長(zhǎng)期、過渡期、第二指數(shù)生長(zhǎng)期和衰亡期。分別對(duì)應(yīng)于細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)基中不同營(yíng)養(yǎng)成分的利用情況及不同的代謝過程。從圖中曲線的兩個(gè)最高峰的出峰時(shí)間和高度可以看出，不同批次的茵梔黃注射液對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)代謝有不同的影響，這也提示我們，采用該方法研究各批次注射液對(duì)該細(xì)菌的影響以評(píng)價(jià)茵梔黃注射液的抗菌作用有一定的合理性。

2.2 金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)在細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)過程中，其指數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的產(chǎn)熱功率與培養(yǎng)時(shí)間之間符合公式［9］:Pt=P0exp(kt)或lnPt=lnP0+kt。

其中，P0，Pt分別是細(xì)菌在指數(shù)生長(zhǎng)的起始點(diǎn)和t時(shí)刻的熱輸出功率。將lnP和t進(jìn)行線性擬合可以得到金黃色葡萄球菌指數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率常數(shù)k;對(duì)各曲線下面積進(jìn)行積分可以得到細(xì)菌生長(zhǎng)過程中的產(chǎn)熱量Q，見表2。其中k1和k2、P1和P2、t1和t2分別為第一和第二指數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)數(shù)率常數(shù)、兩個(gè)最高峰的輸出功率和出峰時(shí)間。

圖2的柱狀圖更直觀和快速地呈現(xiàn)了各批次注射液作用下金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化情況。

表2 茵梔黃注射液作用的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.2 The thermokinetics parameters of S.aureus affected by Yinzhihuang Injection

圖2 7批茵梔黃注射液樣品作用于金黃色葡萄球菌的生物熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)柱狀分析圖Fig.2 The chart for the thermokinetics parameters of S.aureus affected by Yinzhihuang Injection

圖2顯示，相對(duì)于空白對(duì)照(不加注射液)組，各批次注射液作用下金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝曲線的最高峰出峰時(shí)間變化不明顯，而生長(zhǎng)速率常數(shù)、最大輸出功率和總產(chǎn)熱量變化顯著，但是變化規(guī)律不一致，難以準(zhǔn)確分析和比較注射液的抗菌作用。為此，我們引入主成分分析和聚類分析的分析方法，客觀有效地評(píng)價(jià)不同批次注射液的抗菌作用規(guī)律和內(nèi)在質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性。

2.3 主成分分析 主成分分析［10-12］是用于研究試驗(yàn)考察因素與多個(gè)變量間關(guān)系的一種多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，其采用主成分分析思想，將多元變量壓縮為2個(gè)對(duì)全數(shù)據(jù)集貢獻(xiàn)度大致相等的主成分變量Z1和Z2，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)式計(jì)算出各數(shù)據(jù)點(diǎn)的主成分變量集［Z1，Z2］，再將各數(shù)據(jù)組的主成分均值繪在坐標(biāo)系上實(shí)現(xiàn)二維空間投影，從而直觀表達(dá)出試驗(yàn)考察因素的內(nèi)在變化規(guī)律。本文采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件［10］對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明Z1和Z2分別可解釋原來7個(gè)變量(定量熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)52.5%和24.75%的信息，累積解釋77.25%的原信息，提示構(gòu)建的2個(gè)主成分可較好的表達(dá)原來7個(gè)熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)反應(yīng)的各批次注射液的抗菌作用。2個(gè)主成分的表達(dá)式分別為:

上式中熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)前系數(shù)的絕對(duì)值表示該參數(shù)對(duì)主成分的貢獻(xiàn)大小，正負(fù)符號(hào)表示影響方向。由熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)兩個(gè)主成分的共同貢獻(xiàn)率可以看出，分析第一指數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率常數(shù)k1和整個(gè)生長(zhǎng)過程的產(chǎn)熱量Q的數(shù)值變化，可以較快地評(píng)價(jià)7批注射液的抗菌作用差異:相對(duì)于空白對(duì)照(不加藥液)組，7批注射液均有抗金黃色葡萄球菌的作用，且其作用強(qiáng)度為，S5＞S7＞S3＞S6＞S4＞S2＞S1。為了能更直觀地反映這一規(guī)律，本文以空白對(duì)照組為坐標(biāo)原點(diǎn)將主成分坐標(biāo)系進(jìn)行了平移做出了前兩個(gè)主成分的二維投影圖，見圖3(圖中用不同圖例符號(hào)用以區(qū)分各批次樣品)。從圖中可以看出:以正常組為中心，各批次樣品與正常組的距離不同。各樣品距離遠(yuǎn)點(diǎn)的距離遠(yuǎn)大，其抗菌作用越強(qiáng)。圖3也更直觀表明7批注射液的抗菌的作用強(qiáng)度為:S5＞S7＞S3≥S6＞S4＞S2＞S1。

圖3 7批茵梔黃注射液抗菌活性分布圖Fig.3 The antibacterial activity profile of 7 batches of Yinzhihuang Injection

2.4 聚類分析 上述的分析結(jié)果表明了7批次注射液的抗菌作用差異和程度強(qiáng)弱，但是，卻未能反映出此7批注射液內(nèi)在質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性。為此，我們引入了聚類分析的分析方法。以表2中熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)值為指標(biāo)，采用SPSS 13.0軟件對(duì)7批注射液進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。

結(jié)果顯示，7批樣品首先被分為兩大類，S5單獨(dú)成類，為2007年1月生產(chǎn)的某批產(chǎn)品，結(jié)合主成分分析結(jié)果可以得出，此樣品的抗菌作用最強(qiáng)，且質(zhì)量最穩(wěn)定，其余6批樣品聚為一類，表明其內(nèi)在質(zhì)量有一定的相似性，但是沒有S5樣品穩(wěn)定。進(jìn)一步分析表明，此6批樣品又可被分為兩類，其中S1單獨(dú)成類，為2006年6月生產(chǎn)的某批產(chǎn)品，結(jié)合主成分分析結(jié)果可以得出，此樣品的抗菌作用最弱，但質(zhì)量較穩(wěn)定;其余5批樣品的抗菌作用和內(nèi)在穩(wěn)定性較為相似。

圖4 7批茵梔黃注射液樣品聚類分析圖Fig.4 The cluster analysis of 7 batches of Yinzhihuang Injection

3 討論

微量量熱法是基于生化反應(yīng)中普遍存在的熱交換而建立的，它能在不干擾生物體系的正?；顒?dòng)和代謝的情況下，直接監(jiān)測(cè)生物體系代謝過程中的熱效應(yīng)，實(shí)時(shí)、在線、動(dòng)態(tài)、量化地獲得微生物生長(zhǎng)代謝過程中的整體信息，從而反映其他物質(zhì)對(duì)該微生物的干預(yù)作用和藥效強(qiáng)弱，從而有效地彌補(bǔ)了常規(guī)方法信息單一的不足［13］。

金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌的典型代表，在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到，是自然界的優(yōu)勢(shì)菌群。其營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，需氧或兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度37℃，最適生長(zhǎng)pH 7.4，適用于生物熱動(dòng)力學(xué)研究及其它藥物的抗菌作用評(píng)價(jià)。任永申等［14-15］采用微量量熱法分析和比較了多種微生物的生長(zhǎng)代謝情況，結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)周期相對(duì)較短，能夠更快速的實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的檢測(cè)，故本研究選用該細(xì)菌為生物模型評(píng)價(jià)茵梔黃注射液的抗菌作用。

微量量熱法記錄的茵梔黃注射液作用下金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)代謝曲線和熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化，直觀、快速地反映了7批次注射液對(duì)該細(xì)菌的影響;主成分分析結(jié)果顯示第一指數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率常數(shù)k1和整個(gè)生長(zhǎng)過程的產(chǎn)熱量Q的數(shù)值，可以反應(yīng)各批注射液的抗菌作用差異，且其抑菌作用強(qiáng)度順序?yàn)?，S5＞S7＞S3＞S6＞S4＞S2＞S1。聚類分析結(jié)果表明，抗菌作用最強(qiáng)的S5樣品的內(nèi)在質(zhì)量最穩(wěn)定，強(qiáng)于S7和S6樣品;抗菌作用最弱的S1樣品的內(nèi)在質(zhì)量最不穩(wěn)定，弱于S2和S3樣品。以上結(jié)果綜合表明，茵梔黃注射液雖然同為同一藥廠的產(chǎn)品，但是生產(chǎn)時(shí)間、生產(chǎn)批次等因素對(duì)產(chǎn)品的抗菌作用和內(nèi)在質(zhì)量和穩(wěn)定性存在一定的影響。為此，筆者建議，針對(duì)注射液的不良反應(yīng)和事件頻發(fā)的情況，藥廠在生產(chǎn)產(chǎn)品應(yīng)嚴(yán)格控制生產(chǎn)過程、生產(chǎn)環(huán)節(jié)及其相關(guān)因素，且產(chǎn)品在出廠時(shí)應(yīng)嚴(yán)格檢查，確保安全。

本實(shí)驗(yàn)采用微量量熱法，以金黃色葡萄球菌為模式生物，細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝曲線和定量熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)為指標(biāo)，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較7批茵梔黃注射液的抗菌作用和內(nèi)在質(zhì)量差異，為該注射液的質(zhì)量一致性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)提供了方法和模式參考，有望為中藥注射劑的安全使用提供技術(shù)指導(dǎo)。

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