周 利， 王先飛， 施超歐， 陳桂琛， 史 萍*

(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237;2.華東理工大學(xué)分析測(cè)試中心，上海 200237;3.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧 810008)

獐牙菜屬龍膽科Gentianaceae，主要分布于海拔2 200～3 600 m青藏高原和云貴高原的山坡灌草叢中或山谷溪邊，是用于治療黃疸性肝膽疾病和病毒性肝炎的珍稀草本植物，俗稱“藏茵陳”［1］。近年來(lái)，隨著我國(guó)民族醫(yī)藥的迅速發(fā)展，獐牙菜的需求量快速增加，特別是在植物生長(zhǎng)階段的花果期大量采收，導(dǎo)致其資源量銳減和逐漸枯竭，其地域分布亦日益狹窄，野生資源植物瀕臨滅絕［2］。因此，進(jìn)行人工引種和栽培獐牙菜具有重要意義。經(jīng)過(guò)幾年的努力，本課題組已經(jīng)成功完成了包括川西獐牙菜Swertia mussotii和抱莖獐牙菜S.franchetiana等野生獐牙菜類(lèi)植物的人工引種和栽培［3］，也對(duì)植物的部分藥效成分如當(dāng)藥黃素、龍膽苦苷、芒果苷等作了較系統(tǒng)的研究［4-5］。但對(duì)于齊墩果酸在野生和栽培品種的積累狀況還沒(méi)有相關(guān)的數(shù)據(jù)。

齊墩果酸是獐牙菜中富含抗肝炎的最主要藥效成分，具有護(hù)肝降酶、抗炎、強(qiáng)心利尿、降血糖、抗腫瘤的功效［6-10］，分子式:C30H48O3，分子量:456.71，分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 齊墩果酸分子結(jié)構(gòu)式

是白色針狀結(jié)晶，屬于三萜類(lèi)，熔點(diǎn):308～310°C，不溶于水，可溶于乙醇、乙醚、丙酮和三氯甲烷。本實(shí)驗(yàn)研究野生川西獐牙菜和抱莖獐牙菜及人工引種栽培條件下不同部位齊墩果酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和變化，為獐牙菜藥材資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)、引種以及合理利用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)供試樣品材料 野生川西獐牙菜和抱莖獐牙菜藥材取自于青海玉樹(shù)海拔3 500 m左右山地，由中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所盧學(xué)峰研究員鑒定;人工栽培獐牙菜采于平安縣海拔2 500 m引種栽培基地，為兩年生草本植物。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 高效液相色譜儀Agilent 1100 Series(Agilent USA)。包括在線真空脫氣系統(tǒng)，四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測(cè)器;離子阱質(zhì)譜儀LCQ Deca XP Plus(Thermo USA)，ESI負(fù)離子檢測(cè)定性;臺(tái)式離心機(jī) TGL-16B(上海安亭科學(xué)儀器廠);索氏回流提取器(玻璃，自制)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑 齊墩果酸對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110709-200304，供定量測(cè)定用);無(wú)水乙醇，分析純;甲醇，色譜級(jí);乙腈，色譜級(jí);純水，自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品溶液的制備 齊墩果酸在水中溶解度小，但易溶于醇、丙酮、乙酸乙酯等，本實(shí)驗(yàn)參考前人的方法［11-13］，采用75%的乙醇回流提取，具體過(guò)程如下:取不同部位根、莖、葉、花和全枝獐牙菜樣品于60℃烘箱干燥8 h，然后粉碎，精密稱取1 g樣品加入75%的乙醇10 mL，索氏回流提取1 h，放冷后濾過(guò)，殘?jiān)侔创朔椒ㄖ貜?fù)提取2次，合并提取液，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用75%的乙醇溶解濃縮的提取物，并定容至5 mL量瓶中，取濃縮液1 mL于15 000 r/min離心10 min，取上清液供分析備用。

1.3.2 液相色譜及質(zhì)譜條件 液相色譜條件:Hypersil ODS-2 柱 C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水溶液(65 ∶35v/v)，柱溫:30 ℃，體積流量:0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm，進(jìn)樣量:10 μL，用外標(biāo)法定量。質(zhì)譜條件:ESI負(fù)離子/MS/MS檢測(cè)，離子源噴射電壓3.5 kV;毛細(xì)管溫度300℃;毛細(xì)管電壓15 V;鞘氣和輔助氣均為氮?dú)?，體積流量分別為60arb和15arb;碰撞氣為氦氣;檢測(cè)方式采用1～2級(jí)全掃描質(zhì)譜。

1.3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取一定量的齊墩果酸對(duì)照品，用甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為0.212 0 mg/mL的貯備液，15 000 r/min離心5 min，上清液作為對(duì)照品溶液備用。

1.3.4 精密度試驗(yàn) 取齊墩果酸對(duì)照品溶液(0.212 0 mg/mL)，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算齊墩果酸的峰面積，獲得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差值(RSD)。

1.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批獐牙菜藥材5份，依上述方法制備樣品溶液，進(jìn)行重復(fù)性的RSD測(cè)定。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1.3.1 項(xiàng)樣品溶液，分別在 0、2、4、8、16 h進(jìn)樣20 μL，測(cè)定齊墩果酸的穩(wěn)定性。

1.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的藥材樣品5份，分別加入與樣品量之比約為1∶1的齊墩果酸對(duì)照品，按樣品制備方法和測(cè)試條件測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品回收率。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化 因?yàn)辇R墩果酸和甲醇有相近的最大紫外吸收波長(zhǎng)(λmax)，為了降低流動(dòng)相對(duì)齊墩果酸紫外吸收的干擾，參照李路軍等的方法［13］，研究不同的液相色譜條件和洗脫系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在本文的色譜條件下檢測(cè)，基線平穩(wěn)，分離效果好。圖2為試樣品和齊墩果酸對(duì)照品的液相色譜和質(zhì)譜圖譜。由圖2A和圖2B可以看出，齊墩果酸對(duì)照品和樣品圖譜結(jié)果一致，樣品的分離度好(圖2B)。采用負(fù)離子全掃描模式，均可見(jiàn)齊墩果酸［M-H］－準(zhǔn)分子離子峰455.5及455.5的二級(jí)質(zhì)譜中都有相同的407.5的特征子離子峰(圖2C、D)，表明此峰為目標(biāo)物齊墩果酸單一成分。

圖2 試樣和齊墩果酸對(duì)照品液相色譜和質(zhì)譜圖譜

2.2 齊墩果酸成分的測(cè)定

2.2.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取上述齊墩果酸對(duì)照品備用液 2、5、10、15、20 μL 進(jìn)樣，以色譜峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量(X)進(jìn)行回歸，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y=118.29X，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，說(shuō)明在 0.424 ～4.24 μg范圍內(nèi)色譜峰面積與齊墩果酸質(zhì)量之間具有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 齊墩果酸方法學(xué)考察結(jié)果 精密度試驗(yàn)的RSD為0.95%，表明儀器精密度良好;重復(fù)性試驗(yàn)得到 RSD為1.97%，表明該方法的重復(fù)性較好。樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD為2.86%，表明該方法提取獲得樣品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定;回收率試驗(yàn)表明，目標(biāo)物齊墩果酸的回收率可達(dá)98.60%，RSD為2.22%。因此本實(shí)驗(yàn)采用的齊墩果酸測(cè)定方法是可靠的。

2.2.3 樣品中齊墩果酸的測(cè)定 精確取樣品溶液20 μL進(jìn)樣測(cè)定齊墩果酸峰面積，重復(fù)3次。根據(jù)3次面積的平均值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見(jiàn)表1。

對(duì)兩種野生和人工栽培獐牙菜植物的整株以及花、莖、葉、根不同部位齊墩果酸分析計(jì)算結(jié)果如表1所示。由表1結(jié)果可以看出，無(wú)論是野生的還是人工栽培的獐牙菜，整株抱莖獐牙菜中齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于川西獐牙菜中齊墩果酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，高出30%以上;川西獐牙菜和抱莖獐牙菜兩個(gè)品種，無(wú)論是整株還是花、莖、葉和根不同部位，野生品種和人工栽培品種中齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不大。由表1的結(jié)果還可以看出，獐牙菜植物不同部位花、葉、莖和根其齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)不盡相同，花和葉質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，植物根中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低;花和葉中齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高出植物莖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)近5倍、高出植物根的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10倍以上。

表1 獐牙菜不同部位中齊墩果酸

3 結(jié)論

液相色譜條件采用乙腈-水溶液(65∶35v/v)流動(dòng)相，體積流量0.8 mL/min，210 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，對(duì)照品和樣品基線平穩(wěn)、分離度良好。質(zhì)譜分析表明為單一目標(biāo)成分。引種到低海拔的兩種獐牙菜，無(wú)論是川西獐牙菜還是抱莖獐牙菜，野生和人工栽培植物全株中齊墩果酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著變化。對(duì)野生和人工栽培不同生境條件下生長(zhǎng)的獐牙菜，整株抱莖獐牙菜中齊墩果酸量均高于川西獐牙菜中齊墩果酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，花、葉、莖和根不同部位齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)不盡相同，齊墩果酸主要集中在植物的花和葉中，花和葉中齊墩果酸最高，植物根中齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，不到花或葉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的十分之一。結(jié)果表明人工栽培的川西獐牙菜和抱莖獐牙菜藥材仍具有優(yōu)良的品質(zhì).

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