江叔奇， 葛衛(wèi)紅， 吳君金， 石婷婷， 許廣艷， 阮利君

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310053)

冠心蘇合丸源于宋代《太平惠民和劑局方》中的蘇合香丸，是由蘇合香(Styrax)、冰片(Borneolum)、乳香(制)(Resona Boswellia)、檀香(Lignum Santali Albi)、土木香(Inula helenium)等五味藥材組方而成，具有理氣、寬胸、止痛之功效，臨床用于治療心絞痛、胸悶、憋氣等病癥［1］。

丸劑是中藥傳統(tǒng)劑型之一，早在《五十二病方》中就有記述［2］。傳統(tǒng)上，中醫(yī)根據(jù)患者病情辨證論治選用劑型，丸劑常用于病屬輕緩或久病體虛余病未清等癥。然而，傳統(tǒng)中藥丸劑釋放特征及劑型特點(diǎn)的研究，目前多以中藥復(fù)方中的單一或少數(shù)組分進(jìn)行。顯然，這種研究模式不能將中藥及其復(fù)方作為一個(gè)有機(jī)整體，使中醫(yī)藥失去多組分、整體性的特點(diǎn)。

隨著組學(xué)在現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)中的應(yīng)用，特別是在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用，部分學(xué)者提出了多組分中藥釋放動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)方法［3-7］，即以多組分中藥物質(zhì)組(化合物組)為中藥藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)對(duì)象，對(duì)多組分中藥及其復(fù)方進(jìn)行化合物組的釋放動(dòng)力學(xué)的量化表征，評(píng)價(jià)多組分中藥制劑的釋放特征。本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)，采用GC-MS法檢測(cè)，通過(guò)對(duì)不同廠家生產(chǎn)的和同一廠家生產(chǎn)的不同批號(hào)的冠心蘇合丸丸劑間的物質(zhì)組釋放特征進(jìn)行比較研究，為冠心蘇合丸的質(zhì)量控制提供一定的參考方法。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

RCZ-6C2型溶出儀(上海黃海藥檢儀器有限公司);GC-MS-QP2010Plus氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司);Rtx-5MS(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)毛細(xì)管氣相色譜柱(Restek);Avanti J-26XP高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman);Milli-Q Biocel超純水儀(美國(guó)MILLIPORE公司);JA2003N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);KH-250DB型超聲儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥品

冠心蘇合丸(A 廠，批號(hào):8013353，9011245，9012742;B廠，批號(hào):20081201;C廠，批號(hào):096602;D廠，批號(hào):20090201);無(wú)水乙醇(分析純，天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心，批號(hào):20090811);超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

2 原理

中藥物質(zhì)組釋放/溶出動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)方法的基礎(chǔ)是:設(shè)定多組分中藥物質(zhì)組含量為中藥整體性的指標(biāo)，而中藥所含的化合物之間的含量特征關(guān)系是其釋放特征量化評(píng)價(jià)的依據(jù)。將多組分中藥的物質(zhì)組基本組成特征視為標(biāo)準(zhǔn)譜，采用Kalman濾波法計(jì)算，獲得多組中藥在釋放介質(zhì)中的物質(zhì)組釋放量，并得到其釋放動(dòng)力學(xué)［6-11］。

3 方法

3.1 實(shí)驗(yàn)條件

氣相色譜條件:色譜柱為Rtx-5MS(30 m×0.25 mm ×0.25 μm);載氣為高純氦氣 (純度 ＞99.999%);柱體積流量 1.23 mL/min;柱前壓:75.0 kPa;進(jìn)樣口溫度250℃;程序升溫:柱溫60℃，保持3 min，以15℃/min速率升溫至240℃，保持4 min;進(jìn)樣方式:分流進(jìn)樣，分流比為50∶1;進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件:質(zhì)譜檢測(cè)模式:常規(guī)掃描模式(SCAN);電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV;離子源溫度200℃;接口溫度230℃;四級(jí)桿溫度:150℃;質(zhì)量掃描范圍m/z40～500;溶劑切割時(shí)間:3 min。

3.2 陰性對(duì)照溶液的配制

加入500 mL脫氣后60%乙醇溶液于溶出杯內(nèi)，于(37±0.5)℃，漿法 100 r/min下攪拌 10 h，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，依法檢測(cè)并記錄GC-MS圖。

3.3 方法學(xué)研究

3.3.1 各廠家冠心蘇合丸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組溶液的制備

取各廠家冠心蘇合丸(A廠，批號(hào):9012742;B廠;C廠;D廠)各5丸，精密稱定，分別放入研缽，加入50 mL脫氣60%乙醇溶液，研勻，再取450 mL脫氣60%乙醇溶液［12］將混懸藥液洗入溶出杯，在密閉條件下［13］，于(37 ±0.5)℃，漿法 100 r/min 下攪拌10 h，取溶出液適量，5 000 r/min離心15 min，取上清液，即得各廠家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組溶液(A廠家濃度相當(dāng)于8.178 mg生藥/mL;B廠家濃度相當(dāng)于12.706 mg生藥/mL;C廠家濃度相當(dāng)于12.450 mg生藥/mL;D廠家濃度相當(dāng)于8.982 mg生藥/mL)。

3.3.2 物質(zhì)組濃度標(biāo)準(zhǔn)譜測(cè)定

取適量各廠家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組溶液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，按GC-MS法依法測(cè)定，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)出，選取具有主要離子峰的時(shí)間段的離子強(qiáng)度，即得物質(zhì)組濃度標(biāo)準(zhǔn)譜。

3.3.3 線性關(guān)系考察

分別精密移取A廠冠心蘇合丸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置 10 mL量瓶?jī)?nèi)，加60%乙醇溶液至刻度，混勻即得0.408 9、0.817 8、1.635 6、3.271 2、4.906 8、6.542 4、8.178 0 mg生藥/mL的供試液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，按GC-MS法依法測(cè)定，選取標(biāo)準(zhǔn)譜相應(yīng)時(shí)間段的離子強(qiáng)度，并與相應(yīng)的物質(zhì)組濃度標(biāo)準(zhǔn)譜比較，以Kalman濾波法計(jì)算各供試液的物質(zhì)組濃度，考察測(cè)定和計(jì)算方法的線性。

3.3.4 精密度試驗(yàn)

取A廠冠心蘇合丸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組溶液適量，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，進(jìn)樣6次，依法測(cè)定、計(jì)算各樣本物質(zhì)組濃度，以考察測(cè)定和計(jì)算方法的精密度。

3.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取A廠冠心蘇合丸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組溶液適量，避光密封，常溫下放置，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，分別于 0、2、4、8、16、24 h 各依法測(cè)定一次，計(jì)算各物質(zhì)組溶液濃度，以考察測(cè)定和計(jì)算方法的穩(wěn)定性。

3.4 不同廠家冠心蘇合丸的物質(zhì)組釋放

分別取A廠，批號(hào):9012742;B廠;C廠;D廠冠心蘇合丸各6份，每份5丸，精密稱定，放入不同的溶出杯內(nèi)，采用槳法裝置［14］，釋放介質(zhì)為60%乙醇溶液，在密閉條件下［13］，溫度為(37 ±0.5)℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，分別于 30、60、120、180、240 min 取樣10 mL，補(bǔ)加等量的60%乙醇溶液，5 000 r/min離心15 min，上清液以 0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，采用GC-MS法依法測(cè)定，并計(jì)算各廠家冠心蘇合丸的物質(zhì)組釋放度和Weibull分布參數(shù)。

3.5 同一廠家不同批號(hào)冠心蘇合丸的物質(zhì)組釋放

分別取A廠生產(chǎn)的批號(hào)為8013353，9011245的冠心蘇合丸各6份，每份5丸，精密稱定，放入不同的溶出杯內(nèi)，按3.4項(xiàng)下方法，測(cè)定各批號(hào)冠心蘇合丸的物質(zhì)組釋放度和Weibull分布參數(shù)。

4 結(jié)果

4.1 陰性對(duì)照溶液的GC-MS圖譜 見(jiàn)圖1。

4.2 方法學(xué)研究

4.2.1 各廠家冠心蘇合丸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組濃度GC-MS圖

以時(shí)間t(單位:min)為橫坐標(biāo)，離子強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，記錄不同廠家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組溶液GC-MS圖譜(圖2～5)。

圖1 陰性對(duì)照溶液的GC-MS圖譜

圖2 A廠冠心蘇合丸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組濃度GC-MS圖譜

圖3 B廠冠心蘇合丸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組濃度GC-MS圖譜

圖4 C廠冠心蘇合丸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組濃度GC-MS圖譜

圖5 D廠冠心蘇合丸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組濃度GC-MS圖譜

4.2.2 GC-MS法測(cè)定的物質(zhì)組濃度線性

以生藥質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，物質(zhì)組濃度(Gt)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Gt=0.118 5X+0.011 7(r=0.999 7)，結(jié)果表明，冠心蘇合丸溶液的物質(zhì)組濃度在0.408 9～8.178 0 mg生藥/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

4.2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

與冠心蘇合丸物質(zhì)組標(biāo)準(zhǔn)譜相比較，經(jīng)Kalman濾波后，物質(zhì)組濃度計(jì)算結(jié)果為(0.972 5±0.012 7)(n=6)，表明物質(zhì)組濃度測(cè)定方法的精密度良好。

4.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

與冠心蘇合丸物質(zhì)組標(biāo)準(zhǔn)譜相比較，冠心蘇合丸物質(zhì)組溶液在室溫放置24 h內(nèi)物質(zhì)組濃度變化較小，其物質(zhì)組濃度值的波動(dòng)范圍為(0.994 8±0.024 0)(n=6)，說(shuō)明冠心蘇合丸物質(zhì)組溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.3 不同廠家冠心蘇合丸的物質(zhì)組釋放

采用GC-MS法測(cè)定冠心蘇合丸不同時(shí)間點(diǎn)釋放的物質(zhì)組含量，其物質(zhì)組釋放動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)方法計(jì)算結(jié)果顯示，不同廠家生產(chǎn)的冠心蘇合丸的物質(zhì)組含量差異顯著(圖6)，A、B、C、D 4個(gè)廠家生產(chǎn)的冠心蘇合丸240 min內(nèi)物質(zhì)組的平均累積釋放百分率分別為(104.12 ±4.54)，(69.33 ±1.31)，(75.30 ±2.07)，(101.36 ±0.74)。計(jì)算各廠家冠心蘇合丸Weibull分布參數(shù)T50、Td，發(fā)現(xiàn)各廠家丸劑間T50、Td存在顯著性差異(P＜0.01)(表1～2)。

圖6 不同廠家冠心蘇合丸物質(zhì)組釋放曲線(n=6)

表1 不同廠家冠心蘇合丸釋放曲線的Weilbull分布參數(shù) ±s，n=6)

表1 不同廠家冠心蘇合丸釋放曲線的Weilbull分布參數(shù) ±s，n=6)

廠家 T50/min Td /min A廠184.38 ±19.03 199.42 ±22.47 B 廠 186.90 ±10.71 300.06 ±34.43 C 廠 246.32 ±12.90 374.04 ±40.57 D廠114.23 ±5.89 168.07 ±10.79

4.4 同一廠家不同批號(hào)冠心蘇合丸的物質(zhì)組釋放度

GC-MS法測(cè)定計(jì)算結(jié)果顯示，不同批號(hào)的丸劑在各釋放時(shí)間點(diǎn)的物質(zhì)組釋放度有一定差異，但其

表2 不同廠家冠心蘇合丸Weibull分布參數(shù)方差分析

240 min內(nèi)累積釋放的物質(zhì)組含量差異不顯著，近乎均達(dá)到完全釋放(圖7)，批號(hào)為8013353、9011245、9012742的冠心蘇合丸在240 min內(nèi)物質(zhì)組的平均累積釋放百分率分別為:93.79 ±1.53，107.38 ±5.59，104.12 ±4.54。計(jì)算同一廠家不同批號(hào)冠心蘇合丸Weibull分布參數(shù)T50、Td，發(fā)現(xiàn)各不同批號(hào)丸劑間T50、Td不存在顯著性差異(P＞0.05)(表3，4)。

圖7 不同批號(hào)冠心蘇合丸物質(zhì)組釋放曲線(n=6)

表3 不同批號(hào)冠心蘇合丸釋放曲線的Weilbull分布參數(shù)±s，n=6)

表3 不同批號(hào)冠心蘇合丸釋放曲線的Weilbull分布參數(shù)±s，n=6)

批號(hào) T50/min Td /min 8013353 193.38 ±4.87 220.64 ±8.34 9011245 186.51 ±8.65 202.48 ±9.16 9012742 184.38 ±19.03 199.42 ±22.47

表4 不同批號(hào)冠心蘇合丸Weibull分布參數(shù)方差分析

5 分析與討論

5.1 方法學(xué)適用性

冠心蘇合丸物質(zhì)組釋放度測(cè)定方法學(xué)考察結(jié)果顯示，中藥物質(zhì)組釋放動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)理論用于冠心蘇合丸的物質(zhì)組釋放度測(cè)定，方法可行，能夠準(zhǔn)確對(duì)物質(zhì)組進(jìn)行定量。GC-MS法測(cè)定冠心蘇合丸的物質(zhì)組在0.408 9～8.178 mg生藥/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 7)，物質(zhì)組濃度測(cè)定的精密度和測(cè)試液24 h內(nèi)的穩(wěn)定性均較好。

5.2 釋放介質(zhì)的選擇

目前釋放度/溶出度測(cè)定常用的介質(zhì)主要有水、不同濃度的鹽酸溶液、各種濃度的磷酸鹽緩沖液和醋酸鹽緩沖液［15］。但在測(cè)定某些不易溶于上述介質(zhì)的藥物時(shí)，可以在介質(zhì)中加入一定量表面活性劑或有機(jī)溶媒，增加溶解度，使樣品溶出速率增大。由于GC-MS法主要適用于測(cè)定脂溶性物質(zhì)，而脂溶性物質(zhì)在水溶性介質(zhì)中溶解度較小，使藥物釋放溶出有一定的困難，根據(jù)文獻(xiàn)［12］的研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用60%的乙醇溶液作為釋放介質(zhì)，研究冠心蘇合丸的釋放度。

5.3 樣品劑量的選擇

化學(xué)藥的溶出度測(cè)定，通常每次測(cè)定1粒(片)，而服用量多為每次1～2粒(片)。對(duì)于中藥丸劑，一般測(cè)定量不超過(guò)8丸［16］。但當(dāng)冠心蘇合丸的取樣量為1丸時(shí)，某些成分的離子強(qiáng)度低，基線噪音較大，影響測(cè)定的準(zhǔn)確度。因此為提高離子強(qiáng)度，減少實(shí)驗(yàn)誤差，本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定量選擇5丸。

5.4 過(guò)濾膜的選擇及過(guò)濾操作時(shí)注意事項(xiàng)

取樣過(guò)濾時(shí)，應(yīng)注意可能存在的損失。因?yàn)V膜與藥物間有一個(gè)吸附飽和過(guò)程，即濾膜只有吸附到一定量之后，方能達(dá)到飽和、不再吸附［17］。由于試驗(yàn)中的溶出介質(zhì)是60%乙醇溶液，因此在取樣過(guò)濾時(shí)應(yīng)選擇有機(jī)膜，同時(shí)每次過(guò)濾時(shí)應(yīng)先棄除初濾液7～8 mL，取續(xù)濾液1～2 mL作為檢測(cè)液，減少濾膜對(duì)脂溶性成分的吸附。

5.5 溶出裝置的密閉性

由于乙醇和所測(cè)定的成分大多具有揮發(fā)性，為了防止測(cè)定過(guò)程中這些成分的揮發(fā)損失，保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)按照文獻(xiàn)［13］的方法，即采用以橡皮墊覆蓋，密封膜包封溶出杯的方法，并在橡皮墊與槳的接觸處涂抹少量蓖麻油。這樣能有效防止乙醇、冰片等在溶出過(guò)程中的過(guò)度揮發(fā)損失。

5.6 釋放度控制標(biāo)準(zhǔn)是中藥質(zhì)量控制的新視角

實(shí)驗(yàn)中測(cè)定不同廠家的或同一廠家不同批號(hào)的冠心蘇合丸的釋放度，按照物質(zhì)組釋放動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)方法，發(fā)現(xiàn)相同廠家不同批號(hào)的冠心蘇合丸Weibull分布參數(shù)T50和Td沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，而不同廠家生產(chǎn)的冠心蘇合丸Weibull分布參數(shù)T50和Td卻有顯著性差異(P＜0.01)。提示中藥制劑質(zhì)量控制中，在制訂含量控制標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)，有必要制訂基于中藥物質(zhì)組釋放度的中藥復(fù)方固體制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

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