宋 健， 張會敏， 郭承軍， 石俊英*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355;2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟(jì)南 250014)

近年來，流感病毒大規(guī)模流行給人類帶來極大的恐慌，很大程度上影響了人類正常生活，迫切需要加大力度研究開發(fā)新型的抗流感藥物。金銀花具有明確的抗流感病毒作用［1－4］。課題組曾應(yīng)用體內(nèi)外代謝成分指紋圖譜的方法找到了金銀花抗流感病毒的主要效應(yīng)指紋峰［5－7］，本實驗將對效應(yīng)指紋峰利用制備型高效液相色譜儀，快速制得高純度的單峰提取物，再應(yīng)用 HPLC－MS－MS聯(lián)用技術(shù)，得到各成分峰的一級質(zhì)譜圖及二級質(zhì)譜圖，經(jīng)圖譜解析，并參考有關(guān)的文獻(xiàn)資料對色譜峰進(jìn)行了成分歸屬研究，為進(jìn)一步確證金銀花抗流感病毒的有效成分組成奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 實驗材料與儀器

AGILENT 1100 LC高效液相色譜儀(Agilent公司，USA);Venusil XBP－Cl8(4.6 mm × 250 mm，5 μm)色譜柱;AGILENT 1100S(Agilent公司，USA，1361A PrePump VWD);pegasil ODS制備型色譜柱(20 mm ×150 mm，10 μm);AGILENT 1100 LC－MSDTrap－VL型高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent公司，USA)，ZORBAX－RRHT C18(2.1 mm ×30 mm，1.8 μm)超高效色譜柱等。乙腈(色譜純，TEDIA);甲醇(色譜純，TEDIA)，其他所用試劑為分析純。金銀花樣品:產(chǎn)自山東平邑，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)石俊英教授鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試樣品的制備 金銀花的50%乙醇提取物［3］既含有極性化合物，又含有非極性化合物，所含成分復(fù)雜多樣，用HPLC－DAD檢測可得到分離度良好的指紋圖譜，但應(yīng)用同樣的色譜條件進(jìn)行HPLC－MSD聯(lián)用分析，供試液中存在的大量無紫外吸收成分會構(gòu)成強(qiáng)的背景吸收，對質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析形成干擾，因此需要對樣品進(jìn)行必要的除雜處理。我們利用制備型液相色譜儀制備了與金銀花藥材指紋圖譜1號、2號、4號、7號、8號色譜峰相對應(yīng)的高純度提取物，作為液質(zhì)聯(lián)用分析的供試樣品。

2.2 HPLC－MSD 聯(lián)用分析

2.2.1 液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)條件 液相色譜條件 ZORBAX－RRHT C18(2.1 mm ×30 mm，1.8 μm)超高效色譜柱，0→4→6 min流動相梯度為乙腈－0.1%乙酸水溶液10∶90→90∶10→10∶90;體積流量0.4 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件見表1。

表1 MS關(guān)鍵參數(shù)設(shè)置Tab.1 The key parameters of MS

2.2.2 質(zhì)譜檢測 分別精密吸取各樣品溶液5 μL，注入HPLC－MS聯(lián)用儀，依法測定各色譜峰相關(guān)質(zhì)譜。將各樣品峰UV掃描圖、MS圖、MS2圖、相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析。

2.3 圖譜解析與成分鑒定

2.3.1 1號峰的UV掃描曲線與綠原酸極為相似，－MS檢出353［M－H］－，+MS 檢出 355［M+H］+，表明此成分相對分子質(zhì)量為354，與綠原酸一致。推斷此成分應(yīng)為單咖啡?？崴犷悺＃璏S2(353)顯示是以m/z191.0為基峰，參照 Clifford等［4］對綠原酸類化合物MSn質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究結(jié)果，推斷此化合物為5－咖啡?？崴?5－CQA)，其主要離子峰的歸屬見表2。推斷主要碎片離子裂解方式如圖1。

圖1 5-CQA主要碎片離子裂解方式Fig.1 Major fragmentation ions of 5-CQA

2.3.2 2號峰UV掃描曲線與綠原酸及1號峰基本一致，－MS檢出 353［M－H］－，+MS 檢出 355［M+H］+，表明此成分為單咖啡?？崴犷?。－MS2(353)碎片離子顯示 173、179、191、135 由高到低的分布。參照Clifford等［8］對綠原酸類化合物MSn質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究結(jié)果，推斷此化合物為4－咖啡?？崴?4－CQA)，其主要離子峰的歸屬見表2。推斷主要碎片離子裂解方式如圖2。

圖2 4-CQA主要碎片離子裂解方式Fig.2 Major fragmentation ions of 4-CQA

2.3.3 4號峰本為綠原酸對照峰，但應(yīng)用超高效色譜柱進(jìn)行質(zhì)譜分析時發(fā)現(xiàn)原來在普通HPLC的色譜柱上的1個色譜峰卻分成了2個色譜峰。HPLC的DAD檢測器檢出的4號色譜峰5個時間點的UV掃描曲線也顯示，此峰的峰純度較低，除綠原酸UV吸收曲線外，尚顯示另一差異較大的UV吸收曲線，曲線的形態(tài)顯示本品有共軛雙鍵存在，但200nm～250nm之間沒有與苯環(huán)類似的精細(xì)結(jié)構(gòu)存在，基本可排除存在苯環(huán)的可能。排除咖啡酰奎尼酸和黃酮類化合物，可能為環(huán)烯醚萜類。文獻(xiàn)［9］已報道應(yīng)用HPLC－ESI/MS2方法確定4種環(huán)烯醚苷類化合物，總結(jié)了環(huán)烯醚苷類化合物在ESI/MS2質(zhì)譜中的裂解特點:①［M+Na］+峰豐度比［M+H］+要大，②優(yōu)先從糖苷鍵處斷裂，可見豐度較高［M+H－162］+或［M+Na－162］+碎片離子，③苷元易再次通過RDA 裂解產(chǎn)生碎片［M+H－162－70］+或［M+Na－162－70］+。此化合物的質(zhì)譜基本符合上述特點，將金銀花中已知的環(huán)烯醚萜苷類化合物與相關(guān)的文獻(xiàn)［10］進(jìn)行對照，根據(jù)化合物的相對分子質(zhì)量(388)，通過分析分子離子MS2裂解得到碎片離子，初步推定此成分應(yīng)為環(huán)烯醚萜苷類化合物7－epi－vogeloside或vogeloside。其主要離子峰歸屬見表2。推斷主要碎片離子裂解方式如圖3。

圖3 Vogeloside主要碎片離子裂解方式Fig.3 Major fragmentation ions of Vogeloside

2.3.4 7號峰的UV掃描曲線與綠原酸也很相似，－MS檢出367［M－H］－，+MS 檢出369［M+H］+，391［M+Na］+，表明此成分相對分子質(zhì)量為368。其－MS2(367)檢出高豐度的m/z161碎片離子［QMEH－CO2］－(QME 為奎尼酸甲酯縮寫，下同)，+MS2(369)檢出高豐度的m/z163碎片離子［caffeoyl］+，推斷此成分為咖啡酰奎尼酸甲酯，已報道的金銀花單咖啡?？崴峒柞ヒ?位、5位連接為主。文獻(xiàn)報道［8］及本實驗的研究表明3－CQA，5－CQA 的 ESI/－MS2裂解有一定的規(guī)律可循:5－CQA一般只檢出191［quinic－H］－碎片離子，caffeoyloxy 有關(guān)的碎片離子如 179［caffeoyloxy］－，135［caffeoyloxy－CO2］－等極少，3－CQA 能檢出豐度第二的 179［caffeoyloxy］－的碎片離子。這些規(guī)律表明5位連接的咖啡酸奎尼酸在ESI－源裂解過程中苷鍵的斷裂優(yōu)先發(fā)生在咖啡酸一側(cè)，咖啡酰基以自由基的形式離去，不能檢出。將這些特點與本成分的質(zhì)譜圖對照，－MS2(367)檢出了一定豐度的 135［caffeoyloxy－CO2］－，+MS2(369)更是檢出了最高豐度的163［caffeoyl］+。根據(jù)上述分析，推斷此成分應(yīng)為 3－O－咖啡?？崴峒柞?3－OCQME)，其主要離子峰歸屬見表2。推斷主要碎片離子的裂解方式如圖4。

圖4 3-O-CQME主要碎片離子的裂解方式Fig.4 Major fragmentation ions of 3-O-CQME

2.3.5 8號峰的UV掃描曲線顯示與4號峰確證的化合物vogeloside極為相似。－MS基峰為403、807，+MS顯示基峰為427，可推算其相對分子質(zhì)量為404。+MS［M+Na］+豐度甚高，成為基準(zhǔn)峰，與環(huán)烯醚萜苷類質(zhì)譜特點一致。在已知的金銀花所含的環(huán)烯醚萜苷類化合物中具有此相對分子質(zhì)量只有secoxyloganin。分子離子的裂解碎片離子也充分的支持了這一點。因此，推斷此峰為成分Secoxyloganin，其主要離子峰的歸屬見表2。推斷主要碎片離子的裂解方式如圖5。

表2 主要離子峰的歸屬Tab.2 The ownership of the major ions

圖5 Secoxyloganin主要碎片離子的裂解方式Fig.5 Major fragmentation ions of Secoxyloganin

3 小結(jié)與討論

3.1 通過上述HPLC－ESI/MS聯(lián)用技術(shù)，對金銀花指紋圖譜中與抗流感病毒活性密切相關(guān)的幾個色譜峰的成分歸屬進(jìn)行了研究。結(jié)果表明本方法先進(jìn)、簡便，易于操作，較傳統(tǒng)的通過分離純化、1HNMR、13C－NMR、IR、X－ray、MS 等多重光譜數(shù)據(jù)分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定大大節(jié)約了時間與物力。

3.2 通過對UV掃描曲線及ESI/MS及MS2檢測得到的一級及二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并參考已有文獻(xiàn)［11－13］，對質(zhì)譜進(jìn)行了圖譜解析，確定了 1 號、2號、4號、7號、8號色譜峰成分歸屬，質(zhì)譜中各主要離子峰的來源、裂解方式均得到了科學(xué)合理的解釋，因此認(rèn)為各色譜峰的成分歸屬結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。圖譜解析結(jié)果表明:1號峰為5－咖啡酰奎尼酸、2號峰為4－咖啡酰奎尼酸、7號峰為3－咖啡?？崴峒柞?、8號峰為Secoxyloganin應(yīng)為環(huán)烯醚萜苷類化合物 vogeloside 或其構(gòu)象異構(gòu)體7－epi－vogeloside(有可能是其中的1個成分，也可能是2個成分的混合物，空間構(gòu)型的鑒定，還有待進(jìn)一步NMR的數(shù)據(jù)支持，為敘述方便統(tǒng)稱為vogeloside)，加上已知的綠原酸、咖啡酸，通過本研究，金銀花指紋圖譜中與抗流感病毒活性有關(guān)的效應(yīng)指紋峰，其成分歸屬均得到了確認(rèn)。

3.3 綜上所述，金銀花藥材中，與抗流感病毒密切相關(guān)的幾個主要成分已確認(rèn)，除已知的綠原酸、咖啡酸外，還有綠原酸的同分異構(gòu)體4－咖啡?？崴?、5－咖啡?？崴?，及3－咖啡酰奎尼酸甲酯、Secoxyloganin、Vogeloside。涉及到4個咖啡酰奎尼酸類化合物、2個環(huán)烯醚萜苷類化合物及咖啡酸。這些成分結(jié)構(gòu)的確認(rèn)，為金銀花抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供了堅實的實驗基礎(chǔ)，為下一步進(jìn)行成分藥理試驗提供了實驗依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。

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