徐淑芬，田 燕，楊 杰，楊 立，李春美

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢 430070)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界有劇毒的眼鏡蛇的咬傷死亡率高達(dá)90%以上，而目前蛇毒的解毒藥物主要可分為抗蛇毒血清、化學(xué)解毒劑、植物藥、抗蛇毒蛋白4類。其中植物藥由于資源廣泛，生產(chǎn)技術(shù)相對簡單以及成本較低而受到各國學(xué)者的關(guān)注［1］。柿子是我國的傳統(tǒng)特色果品，柿子單寧具有抗氧化、抗腫瘤、解蛇毒等多種活性。植物單寧的生物活性與其聚合度緊密相關(guān)，由于柿子高分子量單寧是復(fù)雜混合物，其解蛇毒活性與聚合度的關(guān)系尚不清楚。本文研究了柿子單寧對眼鏡蛇蛇毒蛋白中酶活的抑制情況。并通過體內(nèi)試驗(yàn)研究單寧對染蛇毒小鼠存活時間的影響。旨在為深入研究柿子單寧的藥理作用，開發(fā)出安全有效的解蛇毒藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1原料與試劑羅田柿子購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場，眼鏡蛇毒蛋白粉購于浙江義烏市蛇類研究所，用SPF級昆明小鼠腹腔注射LD50為0.511 mg·kg-1。甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、β-巰基乙醇、四甲基乙二胺等購于美國Sigma公司，其它試劑均屬于國產(chǎn)分析純。

1.2動物SPF級，昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，♀♂各半，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動物中心［湖北實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證:SCXK(鄂)2008-0005］

1.3柿子單寧的制備按本實(shí)驗(yàn)室的提取工藝，制得高分子量柿子單寧［2］，采用香草醛-硫酸法和蛋白質(zhì)沉淀法對提取物中單寧的含量進(jìn)行測定，含量均在95%以上。用Toyopearl HW-50F凝膠樹脂吸附后分別用體積分?jǐn)?shù)為0.20、0.40和0.60的丙酮水溶液洗脫。依次分別收集后濃縮并冷凍干燥，得到3個柿子單寧級分，分別記為PT20、PT40、PT60。經(jīng)硫解法［3］測定各個組分的平均聚合度(mDP)分別為2.61、23.27、33.37。

1.4柿子單寧對眼鏡蛇蛇毒蛋白中各種酶活力的影響用pH 7.6，濃度為0.05 mol·L-1的Tris-HCl緩沖液配置濃度為1 g·L-1的眼睛蛇毒溶液。將蛇毒溶液與單寧各級分溶液按不同的質(zhì)量比20∶1、5∶1、1∶2混合，37℃保溫反應(yīng)1 h，以10 000 r·min-1離心10 min，得到上清液備用。參考顧海峰等［4］的方法測定各上清液中磷脂酶A2酶、L-氨基酸氧化酶和乙酰膽堿酯酶活力。取20∶1、1∶2混合反應(yīng)上清液分別記為S1和S2，沉淀分別記為C1和C2，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.5柿子單寧對染眼鏡蛇毒小鼠致死毒性的影響昆明小鼠50只，♀♂各半，按體重隨機(jī)分成正常組，蛇毒組，單寧低、中、高劑量組(0.5、1.5、4.5 mg·kg-1)，每組 10 只。正常組腹腔注射生理鹽水，蛇毒組注射3 LD50眼鏡蛇毒溶液，給藥組先注射3 LD50的蛇毒溶液，再立即注射等量的單寧溶液作為中劑量組，給藥組低、中、高劑量比為0.3∶1∶3。觀察24 h內(nèi)小鼠的死亡癥狀和死亡時間。

2 結(jié)果

2.1柿子單寧對眼鏡蛇蛇毒蛋白中各種酶活力的影響以眼鏡蛇粗毒中3種酶的活力分別為1計(jì)，不同聚合度、不同添加量的柿子單寧對蛇毒中3種酶活力的影響如Tab 1所示。隨著單寧含量增加，酶活降低，且呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。這可能是由于隨著單寧濃度的增加，單寧與蛋白質(zhì)結(jié)合方式和位點(diǎn)也會發(fā)生變化。當(dāng)蛇毒與單寧質(zhì)量比為1∶2的時候，酶活幾乎受到完全抑制。隨著聚合度的增加，PT20對酶活的抑制效果最差，PT40和PT60對酶活抑制效果相差不大，這可能是因?yàn)殡S著聚合度增加，單寧與酶蛋白結(jié)合越強(qiáng)，當(dāng)單寧分子量增加到一定的程度后，單寧對酶蛋白抑制程度受單寧分子量影響不大。

Tab 1 Inhibition of enzyme activity of Naja venom by PT fractions with different mean degree of polymerization

選擇PT40做SDS-PAGE電泳分析。粗毒液與1∶2沉淀中的蛋白質(zhì)電泳圖幾乎完全一致，上清液中各組分蛋白質(zhì)隨著單寧的增加顏色變淡，到1∶2的時候，上清液電泳圖中幾乎無蛋白質(zhì)存在，表示當(dāng)蛇毒與單寧質(zhì)量比為1∶2時，PT40對蛇毒蛋白質(zhì)沉淀效果較好。

2.2柿子PT40對眼鏡蛇毒染毒小鼠的體內(nèi)解毒實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠在注射蛇毒5～10 min后，運(yùn)動失調(diào)，心跳加速，呼吸困難，眼瞼下垂，死亡前身體劇烈抽搐。給藥后，染毒死亡小鼠的平均存活時間明顯延長。但是單寧和蛇毒完全作用后，仍有蛇毒對機(jī)體造成損害，但是中毒癥狀得到明顯的減輕。

Tab 2 In vitro detoxifying effects of the PT 40 against Naja naja venom in mice

3 討論

單寧與蛋白質(zhì)的結(jié)合是其最重要的特征，單寧要與蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合體，其分子量是一個重要因素。本實(shí)驗(yàn)研究表明，當(dāng)眼鏡蛇毒與不同聚合度的柿子單寧以不同的質(zhì)量比混合時，隨著單寧含量的增加，蛇毒中的磷脂酶A2、乙酰膽堿酯酶、L-氨基酸氧化酶酶活都受到了很大程度的抑制，且呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，同時抑制效果隨單寧聚合度增加而增強(qiáng)。體內(nèi)試驗(yàn)也證明給藥組的小鼠死亡時間延長，存活率也提高，這說明注射柿子單寧對眼鏡蛇毒引起的毒害有一定的抑制作用。Borges等［7］曾報道芭蕉汁在體外對響尾蛇蛇毒蛋白中的磷脂酶A2、出血毒性、肌肉毒性都有抑制作用，但是在體內(nèi)先注射蛇毒后，再注射藥物卻沒有解毒效果。這種差異可能是由于蛇毒的種類不同以及植物多酚與蛇毒的結(jié)合方式不同所造成的。柿子單寧與蛇毒蛋白質(zhì)的結(jié)合機(jī)制和選擇性及其解蛇毒作用的藥理學(xué)機(jī)制還有待深入的研究。

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