楊玉紅，王靜鳳，龍騰騰，趙 芹，楊延存，馬 琴，薛長湖

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003)

流行病學(xué)研究結(jié)果表明［1］，惡性腫瘤的發(fā)生與攝入脂肪的種類和數(shù)量密切相關(guān)。最新研究發(fā)現(xiàn)［2］，來自海洋魚類的DHA等n-3高度不飽和脂肪酸(n-3PUFA)具有很好的降低腫瘤發(fā)病率的作用。磷脂型DHA(DHA-PC)主要存在于烏賊的肌肉和卵中，是一種新型的天然產(chǎn)物，其中，DHA位于磷脂甘油基的C-2。DHA具有廣泛的生理活性，近年來研究發(fā)現(xiàn)DHA有抑癌活性和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用［3］。磷脂主要存在于動植物細(xì)胞的生物膜和原生質(zhì)中，許多研究表明它具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能［4］。目前已證實DHA-磷脂脂質(zhì)體對腫瘤有明顯的抑制作用，但其作用機制尚不明確［5］。本研究利用從鳶烏賊卵中提取制備的 DHA-磷脂，觀察了DHA-PC對人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡的作用及對裸鼠移植瘤生長的影響，旨在進一步證實DHA-PC的抗腫瘤功效，為其在醫(yī)藥保健領(lǐng)域的開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料BALB/c♂小鼠，17～22 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號為SCXK(京)2007-0001。

人肝癌細(xì)胞系HepG-2和S180肉瘤細(xì)胞株，均由山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。HepG-2細(xì)胞于 RPMI1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每3天傳代1次。S180以腹水型傳代，取接種后生長良好的S180腹水，生理鹽水稀釋，制備瘤細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至4×109·L-1。

1.2藥品和試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、新生牛血清，由美國Gibco公司提供;膽固醇，由日本和光純藥工業(yè)株式會社提供;吖啶橙(acridine orange，AO)和溴化乙錠(ethidium bromide，EB)，由美國Promega公司提供;環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)，由上海華聯(lián)制藥有限公司提供;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3儀器SFE121-50-02超臨界萃取裝置，江蘇南通華興石油儀器有限公司;6980N型氣相色譜儀，美國Agilent公司;1100型液相色譜儀，美國Agilent公司;LF-1型脂質(zhì)體制備儀，加拿大AVESTIN公司產(chǎn)品;FACS.VAN.TAGE流式細(xì)胞儀，美國BD公司產(chǎn)品;IX51倒置顯微鏡系統(tǒng)(DP72照相系統(tǒng))、BX41熒光顯微鏡系統(tǒng)，Olympus產(chǎn)品;680型酶標(biāo)儀，日本BIO-RAD公司產(chǎn)品;Bj5060UV型CO2培養(yǎng)箱，德國Heraeus公司產(chǎn)品。

1.4實驗方法

1.4.1DHA-PC的制備和檢測 鳶卵粉利用超臨界CO2萃取法脫除鳶卵粉中膽固醇［CO2流量為16.7ml·(g·h)-1，萃取釜壓力25M Pa，溫度45℃，萃取時間2 h］，再將上述脫膽固醇的鳶烏賊卵粉利用丙酮脫除中性脂(料液比:1∶15)后，加入95%乙醇提取卵粉中磷脂，高效液相色譜法測得該產(chǎn)物中PC的含量為90%［6］，采用氣相色譜法對其進行脂肪酸分析，測得其中DHA含量為30%。

1.4.2DHA-PC脂質(zhì)體的制備 將DHA-PC與等摩爾的膽固醇用少量三氯甲烷溶于茄形瓶中，充入氮氣保護，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成均勻薄膜，用生理鹽水震蕩混勻，經(jīng)超聲波處理形成乳白色的懸濁液，得到DHA-PC脂質(zhì)體。

1.4.3對腫瘤細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的HepG-2細(xì)胞，按2×103cells/well接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的DHA-PC脂質(zhì)體(0、250、275、300、325、350、375 和 400 μmol·L-1)分別培養(yǎng)48、72、96 h后，加 MTT溶液(終濃度為0.5 g·L-1)，于37℃繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，加入酸化異丙醇200 μl/well，吹打至藍(lán)色結(jié)晶完全溶解，于酶標(biāo)儀570 nm處檢測OD值，并計算IC50值。

1.4.4細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)生長期的HepG-2細(xì)胞，按2×105cells/well接種于6孔培養(yǎng)板。貼壁24 h后加入不同濃度的DHA-PC脂質(zhì)體(0、500 和1 000 μmol·L-1)。48 h 后，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次。將細(xì)胞稀釋至1010·L-1，取100 μl細(xì)胞懸液，加入4 μl AO/EB(1 ∶1V/V)，輕輕吹打混勻后取10 μl滴于載玻片上，蓋玻片封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.4.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布 取對數(shù)生長期的HepG-2細(xì)胞，按2×105cells/well接種于6孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，加入不同濃度的 DHA-PC 脂質(zhì)體(0、600 和1 200 μmol·L-1)。作用48 h后，收集細(xì)胞，用PBS洗2次，輕輕打勻細(xì)胞，加預(yù)冷的75%乙醇固定24 h，PBS洗滌2次后，加入碘化丙錠(PI)染液，4℃避光染色20 min后進行流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.6荷瘤小鼠模型的建立和動物實驗 BALB/c小鼠于右腋窩皮下接種S180瘤細(xì)胞懸液，每只0.2 ml。24 h后隨機分為模型對照組、陽性對照組以及DHA-PC低、高劑量組，并設(shè)不接種腫瘤的小鼠為正常對照組，每組10只。DHA-PC組小鼠分別灌胃不同劑量的DHA-PC脂質(zhì)體(以其中所含DHA為對照確定灌胃劑量，分別為50和200 mg·kg-1)。陽性對照組灌胃Cy(20 mg·kg-1)。正常及模型對照組灌胃生理鹽水，灌胃體積為0.01 ml·g-1，每天1次，連續(xù)14 d。小鼠末次給藥后禁食不禁水12 h，分別稱重，脫頸椎處死，仔細(xì)剝離肉瘤稱重，并計算抑瘤率:抑瘤率/%=(1-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0軟件進行單因素方差分析，同時進行LSD兩兩比較，實驗結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果

2.1對HepG-2細(xì)胞生長的抑制作用DHA-PC脂質(zhì)體作用48 h后，對HepG-2細(xì)胞生長有抑制作用，并且隨作用濃度的增加和時間的延長而遞增，具有一定的量效和時效關(guān)系(Fig 1)。經(jīng)擬合計算，HepG-2細(xì)胞經(jīng)DHA-PC脂質(zhì)體分別作用48、72和96 h 的 IC50值為 411.11、388.22 和 355.66 μmol·L-1。

Fig 1 Effects of DHA-PC on proliferation of HepG-2

2.2對HepG-2細(xì)胞凋亡的影響AO能透過細(xì)胞膜完整的細(xì)胞嵌入DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光。EB僅能透過細(xì)胞膜受損的細(xì)胞嵌入DNA，發(fā)橘紅色熒光。染色后，正常細(xì)胞核染色質(zhì)著均勻的綠色;早期凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)著綠色，呈固縮狀或圓珠狀;晚期凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)為橘紅色，呈固縮狀或圓珠狀;非凋亡的壞死細(xì)胞核染色質(zhì)著均勻的紅色［7］。

正常對照組細(xì)胞核染色質(zhì)著綠色，核形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。經(jīng)DHA-PC脂質(zhì)體低劑量處理48 h后，可見細(xì)胞核固縮，出現(xiàn)早期凋亡特征;而高劑量組可見細(xì)胞被EB染成紅色，核形態(tài)與早期凋亡細(xì)胞相似，為濃染的紅色碎片(核碎裂)或凋亡小體(如Fig 2箭頭所示)，核染色質(zhì)出現(xiàn)著橙色并呈固縮狀，為晚期凋亡的形態(tài)(Fig 2)。表明DHA-PC具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

2.3對HepG-2細(xì)胞周期的影響DHA-PC可明顯影響HepG-2細(xì)胞的周期分布。與正常對照組相比，不同劑量DHA-PC作用48 h后，細(xì)胞SubG1+G0/G1比例明顯增加，分別較正常對照組提高了3.4%和21.83%;細(xì)胞S期變化不明顯，G2/M期明顯減少;DHA-PC低、高劑量組在G1期前均出現(xiàn)典型的凋亡峰，分別高出正常組1.95%和25.88%(見Tab 1和Fig 3)。表明DHA-PC能夠改變細(xì)胞的周期，將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，使其無法進入S期和M期，抑制細(xì)胞增殖。

Fig 2 Effects of DHA-PC on apoptotic morphology of HepG-2(40×object)

Fig 3 Effects of DHA-PCon the cell cycle distribution of HepG-2

2.4對S180荷瘤小鼠抑瘤率的影響不同劑量的DHA-PC均能抑制小鼠S180肉瘤的生長。其中DHA-PC組低、高劑量的抑瘤率分別為33.53%和48.35%，見Tab 2。表明DHA-PC在體內(nèi)具有較好的抑制腫瘤生長的作用。

Tab 1 Effects of DHA-PCon the cell cycle distribution of HepG-2

Tab 2 Effects of DHA-PC on growth of tumor in mice(n=10，±s)

Tab 2 Effects of DHA-PC on growth of tumor in mice(n=10，±s)

＊＊P＜0.01 vs model control group

Model control - 1.864±0.233 -Positive control 20 0.866±0.033＊＊53.53±1.76 DHA-PC medium dosage 50 1.240±0.05＊＊ 33.53±2.88 DHA-PC high dosage 200 0.960±0.06＊＊48.35±2.4

3 討論

近年來，DHA和磷脂及其衍生物的抗腫瘤作用受到了廣泛關(guān)注。許多研究證明［8-11］DHA能抑制直腸癌、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤的增殖，減慢移植瘤生長，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。林彬等［12］的研究證實DHA能進入細(xì)胞內(nèi)抑制HepG-2細(xì)胞的生長增殖并誘導(dǎo)其凋亡。磷脂具有兩親分子結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞膜的構(gòu)成物質(zhì)之一，能夠與細(xì)胞膜結(jié)合，因此結(jié)合有磷脂的物質(zhì)更易于通過細(xì)胞膜進入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。DHA的磷脂分子能夠以結(jié)合形態(tài)由細(xì)胞直接攝取，在細(xì)胞內(nèi)分解為DHA與磷脂，顯示出增效作用［13］。目前已證實［14］，DHA-磷脂對細(xì)胞分化具有誘導(dǎo)作用。本實驗MTT結(jié)果顯示，DHA-PC能夠抑制HepG-2細(xì)胞的生長和抑制小鼠S180肉瘤的生長，說明DHA-PC具有明顯的抑瘤效應(yīng)。

大量研究證實，細(xì)胞周期調(diào)控異常與細(xì)胞癌變密切相關(guān)。細(xì)胞分化的主要標(biāo)志是合成特異性的功能蛋白，出現(xiàn)細(xì)胞類型的功能性改變，同時進行細(xì)胞表型的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，這些標(biāo)志性變化均在G1期由細(xì)胞分化完成。腫瘤細(xì)胞去分化的一個重要特征就是G1→S期卡點失常，進入 S期的細(xì)胞異常增多［15-16］。本實驗結(jié)果表明，DHA-PC可使 HepG-2細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，提示DHA-PC對HepG-2細(xì)胞的增殖抑制作用與其改變細(xì)胞周期分布，減少DNA合成和有絲分裂，促進腫瘤細(xì)胞分化有關(guān)。另外，細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)既影響細(xì)胞分裂又影響細(xì)胞凋亡，許多凋亡的刺激信號在細(xì)胞凋亡之前可誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯，與此同時，細(xì)胞周期調(diào)控的異常也被視為腫瘤發(fā)生的一個重要原因，因此，通過細(xì)胞周期阻滯來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡成為抗腫瘤的一個新靶點［17-19］。樓健穎等［20］報道DHA對胃癌細(xì)胞AGS的增殖具有明顯抑制作用，且AGS經(jīng)DHA處理后細(xì)胞阻滯于G0/G1期，并誘發(fā)明顯的凋亡峰。本實驗結(jié)果也證實，DHA-PC能夠誘發(fā)HepG-2細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)。由此，我們認(rèn)為DHA-PC是通過細(xì)胞周期阻滯抑制HepG-2細(xì)胞增殖、并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用的。

目前，DHA-PC抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機制引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。Kafrawy等［21］研究了DHA-PC對于體外培養(yǎng)的T27A鼠白血病細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)DHA-PC能夠結(jié)合到細(xì)胞膜上并改變其結(jié)構(gòu)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。Hossain等［22］報道DHA-PC能夠誘導(dǎo)CaCO-2細(xì)胞適度凋亡，發(fā)現(xiàn)與凋亡有關(guān)的DNA得到降解，證實這種天然物質(zhì)對于癌細(xì)胞的凋亡有較高的生物活性。細(xì)胞凋亡是一個多階段、多系統(tǒng)參與的極其復(fù)雜的過程，有關(guān)DHA-PC對細(xì)胞周期進程中相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響及其具體的分子機制尚在進一步的研究中。

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