王 寧，周 鵬，2，馮國(guó)清，劉心玉，張培君，吳 斌，胡香杰，喬 鵬

(1.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河南鄭州 450052;2.河南中醫(yī)學(xué)院一附院，河南鄭州 450001)

巴戟天(radix morinda officinalis，RMO)為茜草科植物，肉質(zhì)根入藥，是我國(guó)著名的四大南藥之一，具有傳統(tǒng)的補(bǔ)腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕等作用。巴戟天糖鏈(morindae officinalis oligosaccharides，MOO)是巴戟天醇提物的主要有效成分，本課題組既往研究表明，MOO具有明顯的減輕缺氧/復(fù)氧或缺血/再灌注對(duì)心肌的損傷［1］?？梢源龠M(jìn)雞胚絨毛尿囊血管生成［2］;增加MVD的數(shù)量，而且上調(diào)與血管新生相關(guān)的VEGF、bFGF蛋白的表達(dá)，具有促進(jìn)缺血心肌血管新生的作用［3］。本實(shí)驗(yàn)選擇HUVEC為研究對(duì)象，首次從細(xì)胞水平觀察MOO對(duì)缺氧損傷內(nèi)皮細(xì)胞遷移及管腔樣結(jié)構(gòu)形成的影響，旨在進(jìn)一步觀察MOO促血管生成效應(yīng)，并為其在缺血心肌保護(hù)及促進(jìn)缺血心臟建立側(cè)枝循環(huán)方面的作用提供更加直觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)鄭州大學(xué)生物系多肽生化實(shí)驗(yàn)室祁元明老師惠贈(zèng)。

1.1.2主要藥品及試劑 巴戟天糖鏈(Morinda officinalis oligosaccharides)的制備:巴戟天(購(gòu)自廣東省德慶縣藥材公司，一等品，河南省藥品檢驗(yàn)所李杰鑒定)生藥15 kg粉碎后，分次用體積分?jǐn)?shù)為0.70的乙醇在90℃水浴中煮60 min，將乙醇提取液旋蒸回收乙醇，得濃縮液。用適量的蒸餾水稀釋后，分別用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，棄去乙醚、乙酸乙酯、正丁醇可溶部分，得到醇提物的水溶部分，用層析柱方法分離收集糖鏈部分，其純度為98.76%。實(shí)驗(yàn)用蒸餾水稀釋配成9.0、3.0、1.0 g·L-13種濃度藥液備用;麝香保心丸，上海和黃藥業(yè)有限公司，取1 g加入無(wú)血清RPMI 1640中研磨制成20 ml混懸液，1 500 r·min-1離心去沉淀，再用 0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，4℃保存;Matrigel，BD公司;RPMI 1640培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.1.3主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司;倒置顯微鏡，日本Nikon公司;超低溫高速離心機(jī)D-37520，德國(guó)Heraeus公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC細(xì)胞接種到50 ml玻璃培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)瓶細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右時(shí)用胰蛋白酶(含EDTA)消化傳代。加入體積分?jǐn)?shù)0.1的胎牛血清及1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，以1×108·L-1的密度接種到新細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，輕輕置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。選取3～8代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于模型制備。

1.2.2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型制備及分組 根據(jù)文獻(xiàn)［4］的方法，采用氧清除劑連二亞硫酸鈉造成缺氧，種板培養(yǎng)24 h后，各孔棄去培養(yǎng)基，用無(wú)糖Earle's液洗細(xì)胞2次，正常對(duì)照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基;模型組加入含連二亞硫酸鈉終濃度為1×10-3mol的無(wú)糖 Earle's液，造成細(xì)胞缺氧損傷［5］;陽(yáng)性藥對(duì)照組加入麝香保心丸(SBW，2 g·L-1)，MOO各組加入含連二亞硫酸鈉終濃度為1×10-3mol的無(wú)糖Earle's液及MOO大(0.45 g·L-1)、中(0.15 g·L-1)、小(0.05 g·L-1)，37 ℃孵育 4 h;取出培養(yǎng)板，吸棄各實(shí)驗(yàn)孔液體，用無(wú)糖Earle's液洗細(xì)胞2次，各實(shí)驗(yàn)孔均換含藥的無(wú)血清 RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，造成細(xì)胞復(fù)氧損傷。

1.2.3細(xì)胞生長(zhǎng)狀況檢測(cè) 6孔培養(yǎng)板每孔接種1×105個(gè)HUVEC，培養(yǎng)24 h待其貼壁后，每孔改用含10%胎牛血清培養(yǎng)液同步化處理24 h后并按上述方法進(jìn)行處理，收獲細(xì)胞，加入終濃度為100 μg的RNA酶，37℃水浴30 min后，加入終濃度50 μg的PI熒光染料避光染色30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.4內(nèi)皮細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn) HUVEC在缺氧4 h復(fù)氧12 h后收獲，按文獻(xiàn)方法［6］24孔板每孔加入600 μl正常培養(yǎng)基，放置小室，向小室中加入細(xì)胞懸液 100 μl(1 ×108·L-1)，模型組加入等量 PBS，陽(yáng)性藥物組加入SBW，各給藥組加入大、中、小劑量的MOO，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)4 h。去除濾膜上層細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)0.95的乙醇固定后胎盤(pán)藍(lán)染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取8個(gè)視野。

1.2.5內(nèi)皮細(xì)胞體外小管形成實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［6］的方法。HUVEC在缺氧復(fù)氧處理后收獲，制成2×107·L-1細(xì)胞懸液。96孔板每孔加入50 μl Matrigal，37℃條件下溫育4 h后每孔加入上述細(xì)胞懸液100 μl，模型組加入等量 PBS，陽(yáng)性對(duì)照組加入SBW，MOO各組分別加入大、中、小劑量的MOO，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃條件下培養(yǎng)。18 h后觀察各組細(xì)胞管狀排列狀況及管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量、完整程度，并隨機(jī)選取5個(gè)視野，應(yīng)用Image J軟件分析顯微鏡下每個(gè)視野總的小管面積數(shù)量，結(jié)果以與模型對(duì)照組相比的百分?jǐn)?shù)表示。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 16.0進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析，組間用LSD法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1缺氧復(fù)氧損傷對(duì)HUVEC細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響正常培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞核圓，核膜清晰，呈鋪路石樣單層生長(zhǎng)模式;缺氧復(fù)氧模型后，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞部分脫落，間隙變大，單個(gè)細(xì)胞體積膨大，胞膜呈粗糙褶皺狀，有拉絲現(xiàn)象;SBW組大部分脫落，MOO各劑量組對(duì)HUVEC細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷均顯示出不同程度的保護(hù)作用。

2.2流式細(xì)胞儀檢驗(yàn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況如Tab 1所示，正常組與缺氧復(fù)氧模型組G2+S期的細(xì)胞分別占(26.25±1.44)%和(50.07±4.07)%，兩者差異有顯著性(P＜0.05);MOO大、中劑量G2+S期細(xì)胞為(28.24±2.13)%和(34.23±2.56)%，與模型組差異有顯著性(P＜0.05)。

Tab 1 Effect of MOO on cell cycle in HUVECS injured by hypoxia/reoxygenation

2.3巴戟天對(duì)缺氧復(fù)氧損傷條件下的細(xì)胞遷移的影響如Tab 2所示模型組與正常組相比，細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少(P＜0.05);MOO各劑量組可明顯增加缺氧復(fù)氧模型組細(xì)胞的遷移數(shù)目(P＜0.05)。陽(yáng)性對(duì)照藥組未表現(xiàn)出促進(jìn)缺氧復(fù)氧損傷的內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用。

Tab 2 Effect of MOO on migration of cells injured by hypoxia/reoxygenation(xˉ±s)

2.4MOO對(duì)缺氧復(fù)氧損傷細(xì)胞小管形成的影響如Tab 3所示，正常組與模型組細(xì)胞形成的管腔結(jié)構(gòu)數(shù)量差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，模型組與給藥組相比差別亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，SBW組細(xì)胞狀態(tài)不好，未見(jiàn)有小管形成(Fig 1)。

3 討論

治療性血管新生是指在心衰、心肌缺血、心肌梗死的狀態(tài)下，通過(guò)一些方法的刺激包括某些藥物的治療作用增加功能性的冠狀動(dòng)脈分支或側(cè)支循環(huán)的建立或開(kāi)放，達(dá)到恢復(fù)缺血心肌血供的目的，它為冠心病患者帶來(lái)了一種新的治療策略［7］。內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于血管新生有著很重要的作用［8-9］，故本實(shí)驗(yàn)選用HUVEC為研究對(duì)象。

Fig 1 Effect of MOO on tube formation of cells injured by hypoxia/reoxygenation

Tab 3 Effect of MOO on tube formation of cells injured by hypoxia/reoxygenation(xˉ±s)

細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞急性損傷過(guò)程中心肌細(xì)胞丟失造成心肌受損的重要原因，抗細(xì)胞凋亡可以對(duì)抗心肌的急性缺氧/復(fù)氧損傷［10］。巴戟天能夠?qū)θ毖?復(fù)氧過(guò)程中的心肌細(xì)胞的形態(tài)具有保護(hù)作用［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示各劑量組MOO處理后在未增加細(xì)胞G2+S期比例情況下卻能減少細(xì)胞脫落，表明巴戟天糖鏈具有抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的雙重作用，從而起到保護(hù)缺血心肌的作用。

血管新生是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，單就內(nèi)皮細(xì)胞而言，主要有遷移、增殖和管腔形成等幾個(gè)步驟［12］。缺血缺氧是誘導(dǎo)血管形成的原因之一［13］，而血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成是血管新生的重要環(huán)節(jié)［14］，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和小管形成，可能是促治療性血管生成的機(jī)制之一［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在缺氧復(fù)氧損傷情況下細(xì)胞的遷移卻受到了抑制，遷移的細(xì)胞數(shù)量不足正常條件下的一半，而巴戟天糖鏈能夠在缺氧復(fù)氧損傷條件下促進(jìn)細(xì)胞遷移，使遷移的細(xì)胞數(shù)量維持在一個(gè)很高的水平。同時(shí)在小管形成實(shí)驗(yàn)中，缺氧復(fù)氧損傷模型組細(xì)胞在18 h后才開(kāi)始相互連接，24 h未能在基質(zhì)膠表面形成完整的管腔樣結(jié)構(gòu)，而MOO大、中、小劑量組細(xì)胞培養(yǎng)6 h即可見(jiàn)有細(xì)胞間的相互連接形態(tài)，18 h在martrigel表面形成完整的管腔樣結(jié)構(gòu)，并隨著濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，管腔結(jié)構(gòu)增多，促進(jìn)缺氧復(fù)氧損傷條件下的小管形成。這表明MOO促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管新生，對(duì)MOO既往藥理研究有了進(jìn)一步補(bǔ)充，為缺血心肌保護(hù)及促進(jìn)缺血心臟建立側(cè)枝循環(huán)方面的作用提供了更加直觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)中還存在問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)中設(shè)定的陽(yáng)性藥物麝香保心丸組(SBW)在本實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有表現(xiàn)出來(lái)其應(yīng)有的作用，可能是制備過(guò)程中或者給藥劑量方面的問(wèn)題，我們將在下一步的實(shí)驗(yàn)中對(duì)其查證或換用其他陽(yáng)性藥物。

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