趙莉萍，梅 俏，許建明，姚 強(qiáng)，金 娟

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽省消化病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;安徽合肥 230022;2.安徽淮北職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，安徽淮北 235000)

非甾體類抗炎藥(NSAIDs)是歐美國(guó)家引起藥物性肝損傷的主要因素，雙氯芬酸鈉和舒林酸較為常見［1-2］。研究表明［3］，雙氯芬酸鈉引起肝損傷與線粒體功能受損有關(guān)，線粒體通透性改變(mitochondrial permeability transition，MPT)在雙氯芬酸鈉誘導(dǎo)的肝損傷中具有重要作用，MPT可導(dǎo)致活性氧物質(zhì)生成和線粒體腫脹等引起肝細(xì)胞壞死［4］。藥物性肝損傷除及時(shí)停藥外，目前尚無有效治療藥物。地塞米松是一種糖皮質(zhì)激素，具有抗炎和抑制免疫作用，對(duì)氨基半乳糖、內(nèi)毒素、四氯化碳等所致急性肝損傷具有保護(hù)作用［5］。臨床上有肝臟切除圍手術(shù)期使用地塞米松和治療藥物性肝損傷的部分研

1 材料

1.1動(dòng)物Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，清潔級(jí)，♀、♂各半，體質(zhì)量(230±20)g，南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。室溫、光照周期12 h:12 h條件下飼養(yǎng)1周后使用。

1.2藥物與試劑雙氯芬酸鈉(didofenac，Dof)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，羅丹明123為Solarbio生物公司產(chǎn)品，地塞米松(dexamethasone，Dex)為山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathion，GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、線粒體琥珀酸脫氫酶(SDH)和ATPase活力測(cè)定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2 方法

2.1大鼠藥物性肝損傷模型的制備參照文獻(xiàn)方法［7］，取 SD 大鼠，禁食12 h，自由飲水，雙氯芬酸鈉100 mg·kg-1腹腔注射1次，建立雙氯芬酸鈉誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷模型。

2.2給藥方案SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、地塞米松給藥組(10mg·kg-1)，采用腹腔注射方式給藥，地塞米松于雙氯芬酸鈉注射前1 h給予1次，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組均給予生理鹽水注射。

2.3檢測(cè)方法雙氯芬酸鈉注射24 h后大鼠取血分離血清測(cè)定ALT及AST水平。行肝臟灌流，取肝臟組織用冰生理鹽水制成肝勻漿，肝勻漿MDA、GSH水平和SOD、GSH-Px含量分別按試劑盒操作要求進(jìn)行檢測(cè)。取相同部位肝臟組織固定于4%甲醛液中，行HE染色。另迅速分離、稱量肝組織1 g，置于預(yù)冷的0.25 mol·L-1蔗糖溶液中，按每克肝加9 ml線粒體分離液制成10%肝勻漿，按文獻(xiàn)方法制備肝線粒體［8］。線粒體膜電位采用羅丹明方法檢測(cè)［9］，線粒體腫脹度采用線粒體在520 nm處吸光度降低值檢測(cè)［10］，NADH水平采用 NADH熒光度檢測(cè)［11］。線粒體SDH及ATPase含量按試劑盒操作要求進(jìn)行檢測(cè)。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法結(jié)果以±s表示，采用方差分析，如方差不齊，則采用Dunnet-t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1地塞米松對(duì)大鼠雙氯芬酸鈉肝損傷模型中肝功能和肝臟病理損傷的影響與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清ALT、AST含量明顯增高，肝細(xì)胞呈點(diǎn)片狀壞死，在門脈區(qū)和肝小葉內(nèi)可見細(xì)胞腫脹和變性，匯管區(qū)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，表明雙氯芬酸鈉可導(dǎo)致大鼠急性肝損傷。與模型對(duì)照組比較，地塞米松可明顯降低大鼠血清ALT、AST含量(P＜0.05)，減輕肝病理損傷。提示地塞米松對(duì)雙氯芬酸鈉導(dǎo)致的大鼠急性肝損傷有保護(hù)作用(Tab 1，F(xiàn)ig 1)。

Fig 1 Effects of dexamethasone on liver injury of rats with acute liver injury induced by diclofenac

Tab 1 Effects of dexamethasone on ALT and AST activity in rats with acute liver damage induced by diclofenac(±s，n=8)

Tab 1 Effects of dexamethasone on ALT and AST activity in rats with acute liver damage induced by diclofenac(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs Dcf

Group Dose/mg·kg-1 ALT/U·L-1 AST/U·L -1 Control - 54.13±17.09 155.75±25.70 Dcf - 173.25±65.24＊＊ 949.25±503.93＊＊Dex 10 110.25±41.74# 404.86±254.20##

3.2地塞米松對(duì)大鼠雙氯芬酸鈉肝損傷模型中肝組織MDA、GSH水平和SOD、GSH-Px活性的影響與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肝勻漿中MDA水平升高、GSH水平和SOD、GSH-Px活性明顯降低(P＜0.05)，表明雙氯芬酸鈉導(dǎo)致肝損傷與氧化損傷機(jī)制有關(guān)。地塞米松明顯降低大鼠肝勻漿中MDA水平、升高GSH水平和SOD、GSH-Px活性，表明地塞米松具有減少肝臟氧化損傷作用(Tab 2)。

3.3地塞米松對(duì)大鼠雙氯芬酸鈉肝損傷模型中肝臟線粒體膜電位(MMP)的影響通過測(cè)定熒光值的改變可反映線粒體膜電位的變化。正常對(duì)照組大鼠線粒體加入反應(yīng)液30 s后，熒光值大幅度降低，隨后開始回升，之后基本維持穩(wěn)態(tài)。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組熒光值下降幅度較小，說明模型對(duì)照組線粒體對(duì)羅丹明123的攝取遠(yuǎn)低于正常組，提示線粒體膜電位異常和線粒體損傷。地塞米松組線粒體對(duì)羅丹明123的攝取高于模型對(duì)照組，可明顯改善受損線粒體的功能，保持較正常的膜電位(Fig 2)。

Fig 2 Effects of dexamethasone on MMP of rats with acute liver damage induced by diclofenac

3.4地塞米松對(duì)大鼠雙氯芬酸鈉肝損傷模型中肝臟線粒體腫脹度的影響pH和高鈣均可引起線粒體腫脹度改變，線粒體腫脹時(shí)，表現(xiàn)為線粒體在一定波長(zhǎng)的吸光度減少，可通過測(cè)定光密度值變化來反映。加入pH 7.2的反應(yīng)緩沖液后，正常對(duì)照組線粒體在527 nm處的吸光度緩慢下降，提示因滲透壓異常，線粒體出現(xiàn)腫脹。模型對(duì)照組吸光度下降幅度比正常組低，提示線粒體功能受損，對(duì)環(huán)境pH值變化不敏感。地塞米松組吸光度下降幅度較模型對(duì)照組明顯增加，提示地塞米松可明顯改善受損線粒體的功能，維持對(duì)環(huán)境pH的敏感性(Fig 3A)。加入0.3 mmol·L-1的CaCl2反應(yīng)緩沖液后，正常對(duì)照組線粒體吸光度明顯下降，提示線粒體出現(xiàn)明顯腫脹。

模型對(duì)照組吸光度下降幅度較低，在2 min時(shí)達(dá)到平衡。地塞米松組吸光度下降幅度明顯增加，低于正常對(duì)照組，提示地塞米松可明顯改善受損線粒體功能，維持對(duì)環(huán)境高鈣濃度的敏感性(Fig 3B)。

3.5地塞米松對(duì)大鼠雙氯芬酸鈉肝損傷模型中肝臟線粒體NADH水平和SDH、ATPase活性的影響

NADH是構(gòu)成線粒體呼吸鏈的關(guān)鍵酶，增加能量代謝水平。SDH是線粒體內(nèi)膜結(jié)合酶，是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，參與細(xì)胞能量代謝，ATPase能將ATP催化水解為ADP和磷酸根釋放能量，均與線粒體功能密切相關(guān)。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組線粒體NADH水平和SDH、ATPase活性活性明顯降低(P＜0.01)，地塞米松組NADH水平和SDH、ATPase活性升高(P＜0.01)，提示地塞米松具有增強(qiáng)線粒體呼吸鏈酶活性的作用(Tab 3)。

Tab 2 Effects of dexamethasone on MDA，GSH，SOD and GSH-Px of rats with acute liver damage induced by diclofenac(ˉx ± s，n=8)

Fig 3A Effects of dexamethasone on mitochondrial swelling of rats with acute liver damage induced by diclofenac(pH 7.2)Fig 3B Effects of dexamethasone on mitochondrial swelling of rats with acute liver damage induced by diclofenac(CaCl2buffer)

4 討論

NSAIDs肝損傷中以雙氯芬酸鈉和舒林酸更為常見［12］，雙氯芬酸鈉發(fā)生肝損傷的幾率比其它NSAIDs高5 ～10倍［13-15］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠腹腔注射雙氯芬酸鈉可導(dǎo)致嚴(yán)重肝損傷，表現(xiàn)為血清轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，肝細(xì)胞呈點(diǎn)片狀壞死，地塞米松給藥可明顯降低雙氯芬酸鈉引起的血清轉(zhuǎn)氨酶升高，同時(shí)明顯減輕肝臟病理損傷，提示地塞米松對(duì)雙氯芬酸鈉引起的肝損傷具有明顯保護(hù)作用。

Tab 3 Effects of dexamethasone on the activities of NADH and SDH of mitochondria of rats with acute liver damage induced by diclofenac(xˉ±s，n=8)

雙氯芬酸鈉引起肝損傷的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究表明，氧化應(yīng)激、線粒體功能損傷、能量代謝障礙和細(xì)胞凋亡可能在雙氯芬酸鈉引起肝損傷過程中起重要作用［16-18］。氧自由基是 NSAIDs引起肝細(xì)胞功能損傷的重要原因，SOD和GSH-Px是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化系統(tǒng)，通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，地塞米松可抑制雙氯芬酸鈉引起肝臟MDA水平升高，GSH水平、SOD和GSH-Px活性降低，發(fā)揮抗氧化作用。

線粒體損傷可能是雙氯芬酸鈉肝損傷中的一個(gè)重要機(jī)制，雙氯芬酸鈉可引起線粒體腫脹、線粒體膜去極化和NADP氧化。線粒體跨膜電位是評(píng)價(jià)線粒體功能敏感指標(biāo)，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道開放引起的線粒體膨脹，表現(xiàn)為線粒體光密度減少［19］。因而可通過測(cè)定光密度值變化來反映線粒體的腫脹度。雙氯芬酸鈉損傷后肝臟線粒體對(duì)羅丹明123攝取量，以及對(duì)pH 7.2和高鈣引起線粒體腫脹的敏感性明顯低于正常，提示線粒體功能損傷嚴(yán)重，地塞米松可恢復(fù)線粒體羅丹明123攝取量，維持線粒體腫脹敏感性，提示受損線粒體功能明顯改善。另一方面，線粒體是細(xì)胞能量合成場(chǎng)所，雙氯芬酸鈉可抑制大鼠肝臟線粒體中NADH水平，SDH及ATPase活性降低，導(dǎo)致肝臟能量代謝紊亂。地塞米松可明顯提高線粒體NADH水平，SDH和ATPase的活性明顯增加(P＜0.01)，保護(hù)線粒體電子呼吸鏈，維持線粒體正常能量代謝作用。

綜上所述，地塞米松通過抑制氧化應(yīng)激，恢復(fù)線粒體功能對(duì)雙氯芬酸鈉肝損傷具有保護(hù)作用，為NASIDs相關(guān)性肝損傷的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Aithal G P，Day C P.Nonsteroidal anti-inflammatory drug-induced hepatotoxicity［J］.Clin Liver Dis，2007，11(3):563-75.

［2］García Rodríguez L A，Williams R，Derby L E，et al.Acute liver injury associated with nonsteroidal anti-inflammatory drugs and the role of risk factors［J］.Arch Intern Med，1994，154(3):311-6.

［3］Li Y，Qi X M，Xue X，et al.The relationship between diphenylamine structure and NSAIDs-induced hepatocytes injury［J］.Toxicol Lett，2009，186(2):111-4.

［4］Masubuchi Y，Nakayama S，Horie T.Role of mitochondrial permeability transition in diclofenac-induced hepatocyte injury in rats［J］.Hepatology，2002，35(3):544-51.

［5］甘建和，吳旭東，江敏華，等.地塞米松在D-氨基半乳糖聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠急性肝功能衰竭［J］.中華傳染科雜志，2007，9(25):517-22.

［5］Gan J H，Wu X D，Jiang M H，et al.Mechanisms of dexamethasone treatmen in acute hepatic failure induce by D-galactosamine combined with endotoxin in miace dodles［J］.Chin J Infect Dis，2007，9(25):517-22.

［6］孫延富，王 義，陳科濟(jì)，等.肝切除圍手術(shù)期使用地塞米松保護(hù)肝功能的必要性及可行性研究［J］.中華肝膽外科雜志，2009，10(15):731-4.

［6］Sun Y F，Wang Y，Chen K J，et al.Necessity and feasibility of using dexamethasone for perioperative protection of liver in hepatectomy［J］.Chin J Hepat Surg，2009，15(10):731-4.

［7］Pohl L R，Martin J L，Hargus S J.Immunochemical methods of studying the mechanism of diclofenac-induced hepatitis［J］.Arthritis Rheum，1994，37(10):1557.

［8］Bailey S M，Patel V B，Young T A，et al.Chronic ethanol consumption alters the glutathione/glutathione peroxi-dase-1 system and protein oxidation status in rat liver［J］.Alcohol Clin Exp Res，2001，25:726-33.

［9］Emaus R K，Grunwald R，Lemasters J J.Rhodamin123 as a probe of transmembrane potential in isolated rat-liver mitochondria:spectral and metabolic properties［J］.Biochim Biophys Acta，1986，85:436-48.

［10］Halestrap A P，Davidson A M.Inhibition of Ca2(+)-induced large-amplitude swelling of liver and heart mitochondria by cyclosporin is probably caused by the inhibitor binding to mitochondrialmatrix peptidyl-prolyl cis-trans isomerase and preventing it interacting with the adenine nucleotide translocase［J］.Biochem，1990，268:153-60.

［11］Minezaki K K，Suleiman M S，Chapman R A.Changes in mitochondrial function induced in isolated guinea-pig ventricular myocytes by calcium overload［J］.Physiol，1994，476:459-71.

［12］Aithal G P.Diclofenac-induced liver injury:a paradigm of idiosyncratic drug toxicity［J］.Expert Opin Drug Saf，2004，3(6):519-23.

［13］O'Connor N，Dargan P I，Jones A L.Hepatocellular damage from non-steroidal anti-inflammatory drugs［J］.QJM，2003，96(11):787-91.

［14］Walker A M.Quantitative studies of the risk of serious hepatic injury in persons using nonsteroidal antiinflammatory drugs［J］.Arthritis Rheum1997，40(2):201-8.

［15］Lapeyre-Mestre M，de Castro A M，Bareille M P，et al.Non-steroidal anti-inflammatory drug-related hepatic damage in France and Spain:analysis from national spontaneous reporting systems［J］.Fundam Clin Pharmacol，2006，20(4):391-5.

［16］Sastre J，Serviddio G，Pereda J，et al.Mitochondrial function in liver disease［J］.Front Biosci，2007，12:1200-9.

［17］Kurose I，Higuchi H，Kato S，et al.Oxidative stress on mitochondria and cell membrane of cultured rat hepatocytes and perfused liver exposed to ethanol［J］.Gastroenterology，1997，112(4):1331-43.

［18］Ishii H，Kurose I，Kato S.Pathogenesis of alcoholic liver disease with particular emphasis on oxidative stress［J］.Gastroenterol Hepatol，1997，12(9-10):S272-82.

［19］Martinou J C，Green D R.Breaking mitochondrial barrier［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2001，2:63-7.