管 雨，楊 洋，張智俊，羅淑萍，湯定欽

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

毛竹Phyllostachys pubescens是中國(guó)竹類植物中分布范圍最廣的一個(gè)材用和筍用竹種[1]，不但具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還能產(chǎn)生良好的生態(tài)效應(yīng)。因此，開展毛竹功能基因組學(xué)研究對(duì)于促進(jìn)毛竹遺傳改良，實(shí)現(xiàn)毛竹良種化具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。Hamilton等[2]結(jié)合細(xì)菌人工雜色體（BAC）載體和Ti質(zhì)粒的特點(diǎn)，構(gòu)建了雙元細(xì)菌人工染色體（BIBAC）載體，能夠在農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens介導(dǎo)下直接將外源基因整合到植物基因組中進(jìn)行功能驗(yàn)證，是研究基因功能、基因的表達(dá)調(diào)控以及作物遺傳改良的快速可靠途徑。BIBAC已應(yīng)用于一些植物基因組文庫(kù)的構(gòu)建，如Hamiton等[3]構(gòu)建了番茄Lycopersicon esculentum‘Mogeor’和 Lycopersiconpennellii‘LA716’的大片段 BIBAC 文庫(kù)， Chang 等[4]構(gòu)建了擬南芥Arabidopsisthaliana的BIBAC基因組文庫(kù)，何瑞峰等[5]構(gòu)建了藥用野生稻Oryza officinalis的BIBAC文庫(kù)，Wang等[6]構(gòu)建了鹽芥Thellungiella halophila的BIBAC文庫(kù)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了基因的圖位克隆[7]，其中擬南芥BIBAC基因組文庫(kù)的大規(guī)模轉(zhuǎn)化已經(jīng)完成，這對(duì)植物功能基因組學(xué)的研究具有極其深遠(yuǎn)的意義[8-9]。目前，彭正華等[10]首次對(duì)竹類植物功能基因組學(xué)進(jìn)行了探討，開發(fā)了包括10608個(gè)全長(zhǎng)cDNA片段（FL-cDNAs）和約3萬個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）的毛竹基因資源數(shù)據(jù)庫(kù)；Gui等[11]在竹類基因組學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)水稻O-ryza sativa，高粱Sorghum bicolor與竹類植物有很高的同源性，并認(rèn)為水稻、高粱對(duì)竹類基因組學(xué)的研究有很高的參考價(jià)值。由于竹類植物遺傳背景的研究還比較薄弱，沒有建立高密度的遺傳圖譜，缺乏有效的竹類功能基因組學(xué)研究手段，且大規(guī)模的毛竹功能基因組研究剛剛起步，其基因組測(cè)序須以高質(zhì)量的基因組文庫(kù)為基礎(chǔ)。因此，構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的基因組BIBAC文庫(kù)是毛竹基因組研究必不可少的工作。本研究以雙元細(xì)菌人工染色體（BIBAC）為載體，建立并完善了毛竹大片段基因組文庫(kù)的構(gòu)建體系，構(gòu)建了高質(zhì)量、高覆蓋率的毛竹基因組BIBAC文庫(kù)，以期為毛竹基因組及功能基因的克隆打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

提取大片段基因組DNA的植物材料為毛竹筍，采自浙江省臨安市人工毛竹林。雙元細(xì)菌染色體pCLD04541（由張宏斌老師饋贈(zèng)）大小為23.2 kb，對(duì)四環(huán)素具有抗性，含有LacZ基因；大腸桿菌Eschrichia coli DH10B購(gòu)自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶BamH I，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)λ/Hind III購(gòu)自TaKaRa公司；Lambda Ladder PFG Marker購(gòu)自NEB公司；蛋白酶K購(gòu)自Merk公司，T4連接酶及堿性磷酸酯酶（CIAP）脫磷酸化酶購(gòu)自Fermentas公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 毛竹基因組高分子量核染色體DNA的制備 高分子量（high molecular weight，HMW）DNA的獲得是構(gòu)建大片段基因組文庫(kù)的基礎(chǔ)[12]。本研究根據(jù)Zhang等[13]的程序分離毛竹基因組高分子量核染色體DNA。其基本步驟包括細(xì)胞核的分離與包埋，細(xì)胞核的裂解與HMW DNA的脈沖場(chǎng)凝膠電泳，HMW DNA的大量酶切及脈沖電泳回收。

1.2.2 載體的制備 將含有pCLD04541質(zhì)粒的保存菌株接種于含四環(huán)素的LB（Luria-Bertain）固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)。挑單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基上，按1∶100接種菌液，同條件擴(kuò)繁到20 L。使用堿裂解法提取質(zhì)粒[14]，以氯化銫梯度密度離心純化[15]。將純化后的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sam I分別對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切1 h后，再用脫磷酸化酶于37℃保溫1 h脫磷酸化。根據(jù)質(zhì)粒質(zhì)量濃度，按2×16.67 mkat·g-1的量用BamH I對(duì)pCLD04541進(jìn)行限制性消化，其中酶切反應(yīng)體系和對(duì)酶切后質(zhì)粒進(jìn)行脫磷酸化的操作參考張洪斌的方案[16]。酶切產(chǎn)物8.0 g·kg-1瓊脂糖電泳檢測(cè)，并調(diào)整質(zhì)粒質(zhì)量濃度為10.0 mg·L-1。

1.2.3 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌的制備 將DH10B菌株劃LB平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑單克隆于5 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃220 r·min-1搖菌8 h；按1∶100擴(kuò)繁，同條件繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h，期間及時(shí)檢測(cè)菌液吸光度值；D[λ]600值達(dá)到0.6左右時(shí)，將三角瓶取出后迅速置于冰水浴中冷卻20 min；將菌液轉(zhuǎn)入無菌離心瓶，4000 r·min-1離心5 min；棄上清，加入等體積氯化鈣緩慢重懸菌體，冰浴10 min，4000 r·min-1離心10 min，重復(fù)3次，盡可能棄上清。加入等體積的100.0 g·kg-1甘油，20 μL為單位分裝，垂直插入液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.2.4 感受態(tài)與載體的檢測(cè) 以T4連接酶分別對(duì)脫磷與未脫磷質(zhì)粒載體進(jìn)行自連，各取1 pg進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，通過計(jì)算轉(zhuǎn)化所長(zhǎng)出的克隆數(shù)確定感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率以及質(zhì)粒載體脫磷是否合格。

1.2.5 連接與轉(zhuǎn)化 外源片段與載體按照3∶1的比例進(jìn)行混合，50℃下加熱1 min，冷卻至室溫后加入適量T4連接酶于16℃連接過夜。連接液滴于高分子濾膜上脫鹽和濃縮5～6 h后用于轉(zhuǎn)化。感受態(tài)細(xì)胞與連接產(chǎn)物均勻混合后于電激儀上進(jìn)行電激，然后加入1 mL super optimal broth with catabolite repression（SOC）液體培養(yǎng)基，混勻后轉(zhuǎn)入另一離心管復(fù)蘇1 h。取200 mL菌液涂于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16～20 h進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，并挑取白色克隆。

1.2.6 文庫(kù)插入片段的檢測(cè) 隨機(jī)挑選36個(gè)單克隆接種于LB培養(yǎng)基中，37℃225 r·min-1培養(yǎng)過夜。十二烷基硫酸鈉（SDS）堿裂解小量法抽提質(zhì)粒，以脈沖場(chǎng)電泳檢測(cè)重組質(zhì)粒的大小。根據(jù)R＝N×I/GS（R代表覆蓋度，N代表重組克隆的數(shù)目，I代表平均插入片段大小，GS為物種基因大小，毛竹基因組大小約為2000 MB）計(jì)算文庫(kù)的庫(kù)容。

2 結(jié)果與分析

2.1 大片段基因組DNA的獲得

2.1.1 高分子量DNA的質(zhì)量檢測(cè) 本研究以毛竹筍為材料制備高分子量DNA，通過脈沖場(chǎng)凝膠電泳檢測(cè)所得DNA的分子量大小與濃度，結(jié)果如圖1所示。凝膠栓中毛竹核DNA分子量從大到小呈連續(xù)分布，其中1.0 Mb級(jí)以上的高分子量DNA占有很高的比例，機(jī)械降解的非特異小片段很少，主要分布在0.8 Mb以下，殘余的糖、酚類等雜質(zhì)仍留在膠孔中。因此，制備的高分子量DNA可以用于文庫(kù)構(gòu)建。

圖1 毛竹基因組高分子量DNA脈沖場(chǎng)電泳Figure1 Pulsed field gel electrophoresis of genomic HMW DNA of Phyllostachy pubescens

2.1.2 高分子量DNA的預(yù)酶切 高分子量DNA需經(jīng)過部分酶切才能用于構(gòu)建基因組文庫(kù)，因此，敏感和重復(fù)性良好的部分酶切特性是考察高分子量DNA質(zhì)量的一個(gè)重要依據(jù)。用限制性內(nèi)切酶BamH I對(duì)毛竹高分子量DNA進(jìn)行梯度酶切，隨著酶用量的增加，所得到的基因組DNA限制性酶切片段逐漸減?。▓D2）。這與Zhang等[13]以梯度酶切番茄高分子量的效果一致。說明此毛竹高分子量DNA可以進(jìn)行酶切操作，能夠用于大片段文庫(kù)構(gòu)建。

圖2 毛竹基因組高分子量DNA的梯度預(yù)酶切Figure2 Gradient pre-enzyme digestion of genomic HMW DNA of Phyllostachy pubescens

2.1.3 大片段DNA的制備 ①第1次分離回收。按照預(yù)酶切所確定的酶量對(duì)毛竹基因組DNA進(jìn)行大量的酶切。部分消化的DNA經(jīng)脈沖電泳分離完畢后，將凝膠一側(cè)含DNA標(biāo)記及少量樣品的部分切下進(jìn)行溴化乙錠（EB）染色，在紫外透射儀上用直尺量取50～100 kb的位置。用同樣規(guī)格的直尺量取未染色的凝膠，切取其上100～150 kb位置的凝膠條。如圖3所示，缺失部分為切取的含100～150 kb毛竹基因組DNA片段的凝膠部分。②第2次分離回收。將第1次分離切下的膠塊埋入凝膠中，脈沖電泳完畢后按第1次分離方法切取含有100～150 kb大小片段的凝膠塊。如圖4所示，缺失部分為切取了含目的片段膠塊的部分。

圖3 基因組大片段的第1次分離與回收Figure3 First separation and recycling of Large genomic DNA fragments

圖4 基因組大片段的第2次分離與回收Figure4 Second separation and recycling of large genomic DNA fragments

圖5 回收DNA片段的質(zhì)量濃度Figure5 Concentration of recycling DNA fragments

2.1.4 大片段的濃縮、脫鹽與質(zhì)量濃度測(cè)定把經(jīng)2次分離后切取的含目的片段的凝膠塊放入半透膜中，在脈沖電泳儀中進(jìn)行電洗脫。洗脫完畢后，對(duì)得到的大片段DNA進(jìn)行去硼離子處理，因?yàn)榕痣x子會(huì)影響后續(xù)的連接反應(yīng)[17]。本研究中的大片段DNA經(jīng)過2次回收后質(zhì)量濃度已低于10 mg·L-1，為了后續(xù)連接反應(yīng)的成功，將回收液在0.025μm的Millipore膜上進(jìn)行濃縮，并以已知濃度的λDNA作參照，通過電泳確定濃縮后DNA大片段的質(zhì)量濃度（圖5）。本研究回收大片段DNA的質(zhì)量濃度為20 mg·L-1。

2.2 載體的制備與檢測(cè)

按照SDS堿裂解法制備的pCLD04541質(zhì)粒DNA以氯化銫梯度密度離心純化之后，用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sam I分別對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切。正確的酶切圖譜為：Sam I酶切為2條帶；BamH I酶切為1條帶。圖6的結(jié)果顯示：酶切結(jié)果與正確的pCLD04541物理圖譜吻合。取10 μg純化的質(zhì)粒用BamH I進(jìn)行酶切，再用CIAP將其脫磷酸化，從而得到能夠用于和大片段DNA連接的載體DNA。為了驗(yàn)證載體的脫磷效果，用T4連接酶分別對(duì)脫磷與未脫磷的載體進(jìn)行自連后，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH10B。結(jié)果表明：脫磷后載體自連轉(zhuǎn)化與完整載體轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的克隆數(shù)比例小于1∶50，符合Sambrook等[18]的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。因此，載體脫磷效果較好，絕大部分載體無法自連。

圖6 pCLD04541電泳Figure6 Electrophoresis of pCLD04541

2.3 大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞檢測(cè)

取1 pg pCLD04541質(zhì)粒轉(zhuǎn)化20 μL自制的電擊感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖7所示，自制的大腸桿菌DH10B電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的效率約在1×104菌落形成單位·g-1，不僅降低了研究成本，而且基本滿足建庫(kù)的要求。

圖7 電擊感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果Figure7 Results of shock transformation of competent cells

圖8 重組質(zhì)粒的脈沖場(chǎng)電泳Figure8 Pulsed field gel electrophoresis of recombinant plasmids

2.4 連接與轉(zhuǎn)化

連接產(chǎn)物中鹽離子濃度直接關(guān)系到電擊成功率。將經(jīng)去除硼離子的高分子量DNA與脫磷載體按質(zhì)量比3:1連接后，以自備的DH10B感受態(tài)對(duì)其進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，37℃培養(yǎng)14 h后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選挑取白斑，共104個(gè)克隆，保存于細(xì)胞培養(yǎng)板中，形成毛竹BIBAC基因組文庫(kù)。

隨機(jī)挑取36個(gè)白色克隆，SDS堿裂解法提取質(zhì)粒后，以原始空質(zhì)粒做參照對(duì)重組質(zhì)粒的分子量大小進(jìn)行脈沖電泳檢測(cè)。結(jié)果表明：32個(gè)克隆含有插入子，且重組克隆的分子量大小介于100～150 kb（圖8），而原始質(zhì)粒的大小為27 kb。表明重組克隆的插入片段為90～120 kb，平均長(zhǎng)度為105 kb。按毛竹基因組大小為2000 Mb，該文庫(kù)相當(dāng)于5倍毛竹基因組。

3 討論

常規(guī)DNA提取方法由于在操作過程中不可避免的物理剪切及化學(xué)試劑和核酸酶對(duì)大分子的破壞作用，所獲得的DNA分子量在20 kb左右，無法滿足大片段（100～300 kb）文庫(kù)構(gòu)建的的要求。本研究利用目前較為通用和方便的制備植物基因組高分子量DNA方法提取細(xì)胞核，并將其包埋于瓊脂糖凝膠栓中固化，之后選擇相應(yīng)試劑浸入栓內(nèi)，進(jìn)行細(xì)胞核的裂解和蛋白質(zhì)的去除，從而得到分子量在1 Mb以上的核DNA，最終獲得了毛竹基因組高分子量DNA，為本研究庫(kù)的構(gòu)建奠定了良好的基礎(chǔ)。

限制性內(nèi)切酶BamH I部分酶切染色體DNA成大小不等的DNA片段，一般通過脈沖電泳回收100 kb以上大小的片段。但是在回收的時(shí)候，許多小片段（如＜100 kb）由于阻滯效應(yīng)而混在＞100 kb以上的片段里，在連接反應(yīng)時(shí)影響大片段的克隆。因此，本研究對(duì)酶切得到的大片段DNA進(jìn)行2次條件不同的脈沖電泳，第1次電泳使不同大小的限制性酶切片段初步得到分離，第2次電泳則使初步分離中混雜的小片段得到分離，而90 kb以上的大片段在一定區(qū)域集中，一方面去除了小片段，另一方面較為集中的大片段有利于提高其回收效率。

體外克隆大片段DNA需要高質(zhì)量載體以增加連接效率和減少載體自連頻率。首先適量限制性內(nèi)切酶處理非常關(guān)鍵素，過大酶量會(huì)引起非特異性消化或星活性，少量非特異性酶切產(chǎn)物會(huì)使假陽性克隆大大增加。對(duì)線性質(zhì)粒脫磷酸化處理要適度，脫磷酸化如果不充分，則載體容易自連，處理過度會(huì)導(dǎo)致載體受到損傷無法同外援片段連接，因此，在對(duì)載體進(jìn)行脫磷酸化處理時(shí)，一方面要嚴(yán)格把握堿性磷酸酶（CIAP）的用量，另一方面要精確地控制脫磷酸化反應(yīng)的時(shí)間。本研究使用的CIAP酶量為16.67 mkat·g-1，脫磷反應(yīng)0.5 h后迅速以0.5 mol·L-1乙二胺四乙酸（EDTA）終止反應(yīng)，加入蛋白酶K和SDS后在56℃水浴0.5 h，以使CIAP失活。

在挑取克隆前，將轉(zhuǎn)化平板放在4℃下24 h后，使空載菌落充分變藍(lán)，便于識(shí)別白色菌落降低空載率。本研究構(gòu)建的毛竹BIBAC文庫(kù)含有約1萬個(gè)克隆，隨機(jī)挑取36個(gè)克隆，通過脈沖場(chǎng)電泳檢測(cè)分析后確定所構(gòu)建的毛竹BIBAC文庫(kù)平均插入片段105 kb，獲得重組率較高的陽性克隆，并約覆蓋5倍基因組。本研究為今后毛竹遺傳圖譜構(gòu)建、基因數(shù)量性狀基因座（QTL）定位與克隆、基因組學(xué)的研究打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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