史鋒厚，朱燦燦，沈永寶，施季森

（1.南京林業(yè)大學森林資源與環(huán)境學院，江蘇 南京 210037；2.江蘇省-中國科學院植物研究所，江蘇 南京 210014）

種子調制的方法有多種，其中超聲波處理和聚乙二醇（PEG）滲透調節(jié)同屬于物理調制方法。超聲波是一種機械振動波，具有波長短，能量高，穿透力強，定向傳播等優(yōu)點，其機械效應、熱效應和空化效應具有廣泛的生物學效應，現(xiàn)已被應用到包括種子處理等多種生物領域研究中[1-2]。PEG是一種高分子滲透調節(jié)劑，應用于種子處理，可以提高種子生活力、引發(fā)種子、提高種子發(fā)芽率和縮短發(fā)芽時間等[3-5]。以2種物理方法分別處理種子的研究較多，但將2種方法結合運用于種子處理的文獻報道較少。本研究以中國常見的綠化先鋒樹種油松Pinus tabulaeformis種子為研究材料，通過正交試驗設計對種子進行預處理，探索超聲波處理和滲透調節(jié)組合對種子處理效果，對其應用于種子調制的可行性進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油松種子由河北省林木種苗站提供，為2007年秋季正常成熟的種子。按照國家標準GB 7908-1999《林木種子質量分級》，種子質量分級均為Ⅰ級（發(fā)芽率＞90%，含水量為8%）。種子采收后風干室溫儲藏于南京林業(yè)大學種子中心室內。種子自然老化1 a后，于2008年12月在種子中心生理實驗室進行處理并開展發(fā)芽及生理指標測定；超聲波處理用SK 8200HP超聲波清洗儀（59 kHz,500 W），處理介質為自來水；PEG 6000由中國醫(yī)藥（集團）上海化學試劑公司生產(chǎn)，PEG溶液為質量百分比水溶液。

1.2 試驗設計

試驗采用L934正交試驗設計，試驗因子設計見表1。

依據(jù)正交試驗設計組合，油松種子經(jīng)PEG溶液浸種后再進行超聲波處理，清水沖洗數(shù)次，進行電導率測定和發(fā)芽測定實驗。依照GB 2772-1999《林木種子檢驗規(guī)程》進行苗床發(fā)芽試驗，5×100粒。發(fā)芽溫度為25℃，光照12 h，適量水分，發(fā)芽測定時間為21 d。4×100粒種子進行發(fā)芽測定，統(tǒng)計種子萌發(fā)情況；另100粒種子用于生理指標測定取樣，具體取樣方法為置床72 h后隨機選取種子置于-76℃超低溫冰箱備用，各個生理指標測定重復3次。

表1 油松種子正交試驗因素水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiment for Pinus tabulaeformis seed

1.3 測定指標、測定方法和數(shù)據(jù)處理

①發(fā)芽率PG=G/S，G指在測定時間內正常發(fā)芽種子數(shù)，S指發(fā)芽測定種子數(shù)。②發(fā)芽指數(shù)：IG=∑Gt/Dt。Gt指在不同時間（第t天）的發(fā)芽量，Dt指不同的發(fā)芽試驗天數(shù)。③活力指數(shù)：活力指數(shù) =發(fā)芽指數(shù)×苗鮮質量，苗鮮質量指發(fā)芽結束后，每份發(fā)芽苗中隨機選取10株完整幼苗，天平稱量，以平均值表示苗鮮質量。④相對電導率：測定方法參考種子生理實驗手冊。⑤可溶性糖質量分數(shù)：采用蒽酮比色法測定。⑥淀粉質量分數(shù)：采用蒽酮比色法測定。⑦可溶性蛋白質量分數(shù)：采用考馬斯亮藍法測定。

測定和統(tǒng)計數(shù)據(jù)由SAS 6.12和Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 超聲波處理和滲透調節(jié)處理組合對種子萌發(fā)的影響

超聲波處理和滲透調節(jié)處理分別具有提高種子發(fā)芽率、加速種子萌發(fā)的作用。油松種子發(fā)芽測定指標方差分析和多重對比結果可見表2和表3。方差分析結果（表2）表明：正交試驗設計各組合之間對種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響均達極顯著水平；超聲波處理時間對種子萌發(fā)的影響均達極顯著水平；PEG質量分數(shù)對種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的影響達極顯著水平，對活力指數(shù)的影響達顯著水平 （P=0.0134）；PEG質量分數(shù)和處理時間對種子處理效果具有明顯的交互作用，此交互作用對種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響均達極顯著水平；PEG處理時間對種子萌發(fā)無顯著影響。

由多重比較（表3）可知：利用PEG滲透處理油松種子可以顯著提高種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，這種促進效果隨著PEG質量分數(shù)的增大而增強，以10%PEG溶液處理種子時便可顯著提高種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，經(jīng)20.0%PEG溶液處理后的種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)相比不含PEG處理（0）種子分別提高54.1%，47.8%和36.4%；59 kHz超聲波處理對種子萌發(fā)的作用效果不同，處理時間為10 min時可以提高種子發(fā)芽率，并促進種子快速萌發(fā)，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)比超聲波0 min處理種子分別提高18.0%和18.2%，活力指數(shù)略微下降但差異并不顯著；超聲波處理20 min，種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著下降，比對照分別下降30.0%,33.3%和41.7%。通過方差分析和多重比較，根據(jù)種子發(fā)芽測定結果可得最佳處理組合：油松種子經(jīng)20%PEG溶液浸種12 h，然后59 kHz超聲波處理10 min。

表2 方差分析結果統(tǒng)計Table2 Results of variance analysis

表3 多重對比結果統(tǒng)計Table3 Results of Duncan test

2.2 超聲波處理和滲透調節(jié)處理組合對種子膜透性的影響

種子在浸泡過程中，可溶性物質或電解質通過細胞膜外滲，滲漏越多，細胞膜的完整性越低，浸泡液的電導性就越高，因此，可以利用浸泡液的電導率值反映種子細胞質滲漏情況，定量描述種子活力[8]。對經(jīng)過PEG滲透處理和超聲波處理后的種子測定相對電導率，各處理組合方差分析見表2。各處理組合對油松種子相對電導率影響不顯著，PEG質量分數(shù)和處理時間、超聲波處理對種子相對電導率無顯著影響，PEG質量分數(shù)和時間對相對電導率的影響不存在交互作用。超聲波處理和滲透調節(jié)處理對種子膜透性影響不顯著原因可能與PEG滲透調節(jié)處理使得質膜修復能力提高，即使使用相當劑量的超聲輻射也不能使種子質膜透性增大，PEG滲透調節(jié)能力與超聲波的空化作用可以保護種子質膜的穩(wěn)定性。

2.3 超聲波處理和滲透調節(jié)處理組合對種子萌發(fā)前期物質代謝的影響

種子萌發(fā)啟動后，其內部物質代謝加強，原有儲藏性物質逐漸分解為可溶性物質并被種苗生長所利用，可溶性糖和可溶性蛋白是組織器官生長發(fā)育的能量來源和建構性物質，淀粉是種子中重要的儲藏物質，3種物質的變化可以反映種子萌發(fā)初始階段物質代謝的強弱。

通過對置床72 h后（油松種子萌發(fā)露白時間約為1周，置床72 h正值種子萌發(fā)前期）油松種子可溶性糖、可溶性蛋白和淀粉質量分數(shù)的測定，探索超聲波處理和PEG滲透調節(jié)作用對種子物質代謝的影響。方差分析（表2）可知：不同正交試驗設計各組合之間，種子萌發(fā)前期可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白質量分數(shù)具有顯著差異，其中可溶性蛋白質量分數(shù)的差異達極顯著水平；經(jīng)不同質量分數(shù)PEG溶液處理后種子可溶性糖和可溶性蛋白質量分數(shù)存在極顯著差異；不同時間的超聲波處理后與種子萌發(fā)前期淀粉質量分數(shù)具有顯著差異；PEG質量分數(shù)濃度和處理時間對種子萌發(fā)前期可溶性蛋白的變化影響具有交互作用；PEG處理時間對種子內可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白質量分數(shù)影響均不顯著；不同時間的超聲波處理對可溶性糖和可溶性蛋白質量分數(shù)影響不顯著。由多重對比（表3）可知：PEG質量分數(shù)對種子萌發(fā)前期可溶性糖和可溶性蛋白質量分數(shù)的影響達顯著水平，影響滲透調節(jié)的效果，當使用20%PEG溶液處理種子時，種子可溶性糖和可溶性蛋白質量分數(shù)均高于未處理種子，增幅分別為20.7%和31.7%；與10%PEG溶液處理種子相比也具有顯著差異，分別高23.7%和28.1%。不同時間超聲波處理對萌發(fā)前期的油松種子淀粉和可溶性蛋白質量分數(shù)的影響效果不同，超聲波處理10 min后，種子淀粉下降最快，相比對照下降3.7%；可溶性蛋白相比對照增加最快，增加值為9.07 mg·g-1，增幅達17.7%。超聲波處理時間為20 min時，種子可溶性蛋白增加較少，僅比對照增加1.8%，淀粉分解速度慢于未經(jīng)處理種子。通過綜合分析，以種子萌發(fā)前期可溶性糖、可溶性蛋白以及淀粉質量分數(shù)為衡量標準，超聲波和滲透調節(jié)最佳處理組合為：油松種子經(jīng)20%PEG溶液處理后再經(jīng)59 kHz超聲波處理10 min。

3 結論與討論

3.1 PEG滲透調節(jié)促進種子萌發(fā)

PEG作為一種惰性高分子滲透保護劑，其溶液具有降低水勢的作用。PEG處理促進種子萌發(fā)的原因在于PEG溶液通過滲透調控種子細胞吸水速度，修復細胞膜，恢復種子活力[3-4]，但不同學者對PEG處理是否對種子萌發(fā)代謝存在啟動和促進作用存在爭論[9]。本試驗中，經(jīng)過PEG溶液處理的油松種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均有提高，說明PEG處理確實可以促進種子萌發(fā)。這與張偉峰等[3]、孫建華等[4]、丁永樂等[5]和Mc Donaldm[10]報道結論相符合。在本試驗中，PEG促進種子萌發(fā)的作用隨著溶液質量分數(shù)的增大而增強，20%PEG溶液表現(xiàn)出了較好的效果，均顯著提高了種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，同時也顯著促進了種子內可溶性糖和可溶性蛋白的代謝。這與洪法水等[11]、陳源等[12]、劉杰等[13]報道相符合。在本試驗中僅設置2種質量分數(shù)處理和3種時間處理梯度，所表現(xiàn)出的規(guī)律性還相對有限，在今后的研究中應增加設置梯度，從而使得實驗結果更加可靠；同時種子PEG滲調條件的選擇應以種子為出發(fā)點，圍繞種子吸水過程，結合PEG溶液所能營造的滲調氛圍，進行合理的選擇[9]。

3.2 超聲波處理促進種子萌發(fā)

超聲波的生物學效應主要表現(xiàn)在空化、熱效應和機械效應以及消毒效應[1-2，14]，可以加速種子萌發(fā)，提高種子發(fā)芽率和發(fā)芽速度，這已在本試驗中被驗證。這與莊南生等[15]、李剛等[16]、孫群等[17]報道相符合。59 kHz超聲波處理10 min，對油松種子萌發(fā)的促進作用最為明顯，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別增加18%，同時經(jīng)該時間處理的油松種子在萌發(fā)前期，淀粉分解相對加快，可溶性蛋白顯著提高。但處理時間為20 min時，超聲波處理不僅未表現(xiàn)出對種子萌發(fā)的促進作用，反而抑制種子萌發(fā)，原因可能在于超聲波時間超過適宜范圍，超聲波對包括細胞膜在內的細胞組織器官產(chǎn)生了破壞作用，導致種子活力下降。

3.3 油松種子處理最佳優(yōu)化體系

通過L934正交試驗設計，探索超聲波處理和PEG滲透調節(jié)對種子萌發(fā)的影響，依據(jù)發(fā)芽測定結果和營養(yǎng)物質代謝測定指標，選擇油松種子利用59 kHz超聲波和PEG滲透調節(jié)處理的最佳組合為：20%PEG溶液浸種24 h，然后經(jīng)59 kHz超聲波處理10 min。該組合在正交試驗設計表中未出現(xiàn)，需要具體實驗驗證。同時根據(jù)本試驗結果，可將超聲波處理和滲透調節(jié)處理綜合運用于油松種子生產(chǎn)調制。

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