陳裕新 ， 夏志蘭 **， 劉東波 ， 康信聰 ， 熊興耀

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)能源研究中心，湖南 長沙 410128）

靈芝 （Ganoderma lucidum）屬真菌界、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、靈芝科、靈芝屬，為大型的藥用真菌。有著 “仙草”的美譽(yù)，是名貴的藥材，被廣泛應(yīng)用于藥品和食品中，具有益心氣、益肺氣、安神補(bǔ)肝、堅(jiān)筋骨、通九竅等多種藥效，同時還兼有養(yǎng)生美容，延年益壽的功效[1]。

單核菌絲又名初生菌絲，是由孢子直接萌發(fā)形成的菌絲，每個細(xì)胞內(nèi)只有1個細(xì)胞核；雙核菌絲又稱次生菌絲，是由二條遺傳性狀不同的異質(zhì)菌絲相互融合而成，每個細(xì)胞內(nèi)有2個細(xì)胞核，具有鎖狀聯(lián)合，是形成子實(shí)體的菌絲形態(tài)。分離單核菌株是大型真菌雜交育種的必經(jīng)之路[2，3]，同時也研究擔(dān)子真菌極性、結(jié)合方式和交配型基因及遺傳多樣性分析的重要材料[4－7]。

目前，國內(nèi)外對靈芝的栽培、藥理作用研究較多，但對靈芝的孢子萌發(fā)、雜交育種及其單核、雙核菌絲的遺傳特性研究較少，本文就靈芝單核菌絲與雙核菌絲的生長特性進(jìn)行比較試驗(yàn)，為靈芝雜交育種提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)，為靈芝的基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料美國靈芝 （Ganoderma americanense），由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

采用鐘罩法 （子實(shí)體彈射法）[8]收集無菌孢子，配置無菌孢子懸浮液，并梯度稀釋到光學(xué)顯微鏡100×視野下只有2個～3個孢子，最后直接涂布至平板，置于28℃下暗培養(yǎng)，獲得單個孢子萌發(fā)菌落。經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察均無鎖狀聯(lián)合，為單核菌株，隨機(jī)抽取6個單核菌株，并依次編號為P1 （Primary）、 P2、 P3、 P4、 P5、 P6。 將母種的雙核菌株標(biāo)記為S（Secondary）。

固體培養(yǎng)基配方 （培養(yǎng)基1）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀 1 g、硫酸鎂 0.5 g、瓊脂20 g，水1 000 mL， pH 值 6.5。

液體培養(yǎng)基配方 （培養(yǎng)基2）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂 0.5 g、蛋白胨2 g、酵母膏2 g， 水 1 000 mL， pH 值 6.5。

固體平板培養(yǎng)，每個菌株接10個培養(yǎng)皿，設(shè)置3個重復(fù)，接種后置于22℃下暗培養(yǎng)。

液體培養(yǎng)，采用250 mL三角瓶，每瓶裝液150 mL，每個菌株接5瓶，設(shè)置3個重復(fù)。接種后放在22℃下靜置24 h后，轉(zhuǎn)入搖床培養(yǎng)。

1.2.1 單核、雙核菌株在平板上的延伸直徑

將7個不同菌株接種于培養(yǎng)基1。培養(yǎng)10 d后用量尺測量菌株在培養(yǎng)皿中延伸的直徑大小。

1.2.2 單核、雙核菌株在平板上的吐水?dāng)?shù)及平均直徑

將7個不同菌株接種于培養(yǎng)基1。培養(yǎng)15 d后在光學(xué)顯微鏡100×視野下觀察，記錄每個視野下菌株的吐水?dāng)?shù)量和平均直徑，并按球體體積公式計(jì)算出平均每個視野下吐水的總體積 （V），公式為：

注：n為吐水?dāng)?shù)量；d為平均直徑。

1.2.3 單核、雙核菌株在液體培養(yǎng)中的菌絲產(chǎn)量

將7個不同菌株接種于培養(yǎng)基 2。22℃、120 r·min－1黑暗搖瓶培養(yǎng)。7 d后紗布過濾收集菌絲，50℃下烘干稱重。

1.2.4 單核、雙核菌株的液體培養(yǎng)溫度試驗(yàn)

將P4、S兩個不同菌株接種于培養(yǎng)基2。設(shè)置19℃、22℃、 25℃、 28℃四個搖床培養(yǎng)溫度梯度， 120 r·min－1黑暗培養(yǎng)。搖瓶培養(yǎng)7 d，紗布過濾收集菌絲，50℃下烘干稱重。

1.2.5 單核、雙核菌株的液體培養(yǎng)pH值試驗(yàn)

培養(yǎng)基2中pH值設(shè)置5、6、7、8、9共5個梯度，接種P4、S兩個不同菌株。22℃、120 r·min－1黑暗培養(yǎng)。7 d后紗布過濾收集菌絲，50℃下烘干稱重。

1.2.6 單核、雙核菌株的液體培養(yǎng)光照試驗(yàn)

將P4、S兩個不同菌株接種于培養(yǎng)基 2。在22℃、120 r·min－1， 0、 500 lx、 1500 lx 三個光照強(qiáng)度梯度培養(yǎng)。7 d后紗布過濾收集菌絲，50℃下烘干稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 單核、雙核菌株在平板上的延伸直徑

不同菌株在培養(yǎng)皿平板上的生長情況比較見表1。

表1 不同菌株在培養(yǎng)皿平板上的生長情況比較

由表1可知，雙核菌株S的延伸直徑最長，為7.26 cm；各單核菌株延伸直徑都遠(yuǎn)小于雙核菌株，其中P4菌株延伸最長，為5.94 cm。菌株延伸直徑由大到小排列依次為 S＞P4＞P1＞P6＞P5＞P2＞P3。 單核菌絲 P1 菌絲最濃厚，P4最薄。除單核菌株P(guān)1有較多氣生菌絲外，其余都為匍匐生長。雙核菌絲在固體培養(yǎng)基中的生長總體趨勢強(qiáng)于單核菌絲，但菌絲濃密程度與單核菌絲差異不大，這可能由于單核菌絲的分枝能力較強(qiáng)，分枝生長的速率抵消了部分雙核菌絲的生長速度。因此從形態(tài)上觀察，菌絲濃密程度沒有太大差異 （參看圖4）。

2.2 單核、雙核菌株在平板上的吐水?dāng)?shù)及平均直徑

不同菌株在培養(yǎng)皿平板上的吐水情況比較見表2。

表2 不同菌株在培養(yǎng)皿平板上的吐水情況比較

由表2可知，雙核菌株S的平均吐水?dāng)?shù)最少，僅為11.3個；各單核菌株的平均吐水?dāng)?shù)遠(yuǎn)多于雙核菌株，其中單核菌株P(guān)4最多為95.7個。水珠平均直徑以單核菌株P(guān)3的最大，為68.2 μm，雙核菌株S次之；各菌株間直徑大小差異較大。平均總吐水體積以單核菌株P(guān)6最多，為9.382×10－3mm3， 其次單核菌株 P3， 最少的為雙核菌株。試驗(yàn)表明，單核菌絲對水分極其敏感，水分過多就立即以吐水的方式向外排水，單核菌絲對氧氣的需要要敏感于雙核菌絲 （參看圖5）。

2.3 單核、雙核菌株在液體培養(yǎng)中的菌絲產(chǎn)量

不同菌株在液體培養(yǎng)中的菌絲產(chǎn)量比較見表3。

由表3可知，菌絲產(chǎn)量由高到低依次為 S＞P4＞P6＞P5＞P2＞P3＞P1。其中，雙核菌株S的液體培養(yǎng)產(chǎn)量最高，為0.3833 g·瓶－1； 其次為單核菌株 P4， 產(chǎn)量為 0.3567 g·瓶－1；單核菌株P(guān)1最低，為0.15 g·瓶－1。試驗(yàn)表明，雙核菌絲在液體培養(yǎng)中的生長勢強(qiáng)于單核菌絲，各單核菌絲間生長勢差異較大，也說明各單核菌株間存在較大遺傳差異。

表3 不同菌株在液體培養(yǎng)中的產(chǎn)量比較

2.4 單核、雙核菌株的液體培養(yǎng)溫度試驗(yàn)

不同液體培養(yǎng)溫度處理對單核、雙核菌絲產(chǎn)量的影響見圖 1。

雙核菌株S在溫度22℃時，菌絲產(chǎn)量最高，為0.3650 g·瓶－1，是其最適生長溫度。而單核菌株的最適生長溫度則為25℃， 菌絲產(chǎn)量為0.3533 g·瓶－1。 由圖 1的變化幅度可知，單核菌絲對溫度變化感應(yīng)比雙核菌絲的敏感，產(chǎn)量隨溫度變化較大。試驗(yàn)表明，單核菌絲對溫度變化敏感于雙核菌絲。

2.5 單核、雙核菌株的液體培養(yǎng)pH值試驗(yàn)

不同液體培養(yǎng)pH值處理對單核、雙核菌絲產(chǎn)量的影響見圖2。

雙核菌株S在pH值為5時，菌絲產(chǎn)量最高，達(dá)到了0.4833 g·瓶－1。而單核菌株的最適生長pH值則為6，菌絲產(chǎn)量為0.42 g·瓶－1。由圖2的變化幅度可知，單核菌絲對pH值變化的感應(yīng)比雙核菌絲的敏感，產(chǎn)量隨pH值變化較大。試驗(yàn)表明，單核菌絲對pH值變化敏感于雙核菌絲。

2.6 單核、雙核菌株的液體培養(yǎng)光照試驗(yàn)

不同液體培養(yǎng)光照處理對單核、雙核菌絲產(chǎn)量的影響見圖 3。

由圖3可知，單核、雙核菌株最適宜的光照強(qiáng)度都為0， 產(chǎn)量均達(dá)到最高值， 分別為 0.3867 g·瓶－1和 0.38 g·瓶－1，即黑暗都有利于菌絲生長，光照對菌絲生長有抑制。由圖3變化幅度看出，隨著光照增加，雙核菌株產(chǎn)量遞減程度要大于單核菌絲，即光照變化對雙核菌株的影響比單核菌株大，雙核菌絲對光照更為敏感。不同菌株在平板上的生長情況見圖4～圖7。

3 小結(jié)與討論

單核、雙核菌株在平板上的延伸直徑和液體培養(yǎng)中的菌絲產(chǎn)量2個實(shí)驗(yàn)中，多個單核菌株間生長速度和生長勢出現(xiàn)了一定程度差異性，這與何培新[9]、李榮春[10]等在研究單核菌株時所出現(xiàn)菌株間差異性結(jié)果相似。這可能由于在雙核菌絲減數(shù)分裂形成孢子過程中，遺傳物質(zhì)再次分配，出現(xiàn)不同基因型，從而表現(xiàn)出較大的差異性。此外，2次試驗(yàn)的菌株生長速度和生長勢大小排列順序基本一致，只有P1出現(xiàn)了較大偏差，這可能由于P1菌株具有較多的氣生菌絲，生長過程中需要較多氧氣，而在液體培養(yǎng)中由于供氧較少，氧氣便成為其生長的最大影響因素，因此液體培養(yǎng)菌絲產(chǎn)量較低，而固體培養(yǎng)中菌絲生長最快。

在水分、溫度、pH值的差異方面，單核菌絲適應(yīng)能力都弱于雙核菌絲。但在光照試驗(yàn)中，單核菌絲對光照變化的適應(yīng)性上要強(qiáng)于雙核菌絲，雙核菌絲對光照更為敏感，這可能由于雙核菌絲在形成子實(shí)體過程中具有對光照的感性，而單核菌絲則沒有或不強(qiáng)。在單核菌絲結(jié)合形成次級菌絲過程中，增強(qiáng)了對光照的敏感性，用來加強(qiáng)子實(shí)體原基形成對外界環(huán)境因素的感應(yīng)能力；因此適量光照處理可誘導(dǎo)一些食用菌子實(shí)體原基形成。單核菌絲生長勢總體弱于雙核菌絲，表現(xiàn)在對環(huán)境因素變化的適應(yīng)能力[11，12]。

自然界許多植物都有吐水現(xiàn)象，當(dāng)土壤水分充足，空氣潮濕，無風(fēng)且溫度較低的天氣，未受傷的植物可從葉尖、葉緣部位的水孔向外溢出液滴，叫做吐水現(xiàn)象[13]。大型真菌菌絲體中吐水現(xiàn)象比較少見，通過顯微觀察手段才能清晰看到吐水現(xiàn)象。單核、雙核菌絲均能在一定條件下吐水，單核菌絲對水分更敏感，因此吐水現(xiàn)象更頻繁。

靈芝單核菌株與雙核菌株在水分、溫度、pH、光照上都存在較大生理形態(tài)差異，雙核菌株對環(huán)境適應(yīng)能力要強(qiáng)于單核菌株。

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