黃達(dá)明 ， 李 欣 ， 黃 翀 ， 張志才 ，4**， 孫文敬

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江西省生物發(fā)酵食品添加劑工程技術(shù)研究中心，江西 上饒 334221；3.南京郵電大學(xué)通信與信息工程學(xué)院，江蘇 南京 210046；4.北京綠科天成生物有限公司，北京 100089）

在糖尿病的治療方面，目前降血糖的方法大部分是注射胰島素，但這種治療方法大都是短時(shí)的，并且易出現(xiàn)多種副作用。葡萄糖的吸收利用包括葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞以及葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)分解。葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞的主要方式是協(xié)助擴(kuò)散，擴(kuò)散速率受細(xì)胞內(nèi)外葡萄糖濃度差值、擴(kuò)散系數(shù)以及葡萄糖與細(xì)胞膜上載體的親和力的影響。提高葡萄糖代謝，降低細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度有利于提高葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞的速率。糖耗量是反映糖代謝速率一個(gè)重要指標(biāo)。肝臟又是機(jī)體吸收利用葡萄糖的重要器官之一。對(duì)于葡萄糖的消耗，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道大都在細(xì)胞水平或體內(nèi)分子水平上研究，且主要以刺激胰島素分泌和耗氧量作為檢測(cè)指標(biāo)[1-8]，但是這兩個(gè)指標(biāo)不能準(zhǔn)確地反應(yīng)組織代謝水平。

樹舌 （Ganoderma applanatum）屬真菌門 （Eumycota）、擔(dān)子菌亞門 （Basidiomycotina）、 層菌綱 （Hymenomycetes)、非菌褶目 (Aphyllophorales)、 靈芝菌科 （Ganodermataceae）、靈芝屬 （Ganoderma），是重要的藥用真菌之一。樹舌主要成分包括多糖、甾體化合物、三萜、脂類、氨基酸以及微量元素等[9，10]。樹舌性平，氣微、味淡[11]，具有清熱、消積、化痰、止痛等功效[12]。作為一種藥用真菌，在人類治療疾病方面發(fā)揮著重要作用。隨著對(duì)樹舌研究的不斷深入，其藥用價(jià)值已引起人們的高度重視。

試驗(yàn)以糖耗量為指標(biāo)，對(duì)樹舌發(fā)酵液提高離體肝臟糖耗量的條件進(jìn)行了研究，篩選并優(yōu)化出合適的樹舌發(fā)酵條件，試圖研究出其降血糖機(jī)理，以期為樹舌大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)相關(guān)降糖產(chǎn)品提供理論支持和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

樹舌：由中國(guó)科學(xué)院地球化學(xué)研究所連賓老師饋贈(zèng)，現(xiàn)存于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)AC CC52297。

1.2 培養(yǎng)基

麥麩固體培養(yǎng)基：麥麩15 g，水20 mL；種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g（煮汁）、葡萄糖20 g，水1 000 mL；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨4 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂 0.5 g、 氯化鉀 0.5 g、 硫酸亞鐵 0.1 g， 水 1 000 mL，自然pH。

1.3 儀器設(shè)備

HH－S數(shù)顯恒溫水浴鍋 （江蘇金壇醫(yī)療儀器廠）；全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋YX－400Z（上海三申醫(yī)療器械廠）；PSX智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 （寧波萊福特科技有限公司）；全控溫恒溫?fù)u床 （YC－W冷凍型，鎮(zhèn)江格瑞生物工程公司）；可見(jiàn)分光光度計(jì)7200（尤尼柯上海儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 菌種培養(yǎng)

將樹舌菌種接種到麥麩固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)7 d后，轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)基，28℃、150 r·min－1培養(yǎng) 3 d， 以 10%接種量，轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在同樣的條件下培養(yǎng)5 d。

1.4.2 單因素試驗(yàn)

不同的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、營(yíng)養(yǎng)因子、pH作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分。碳源優(yōu)化分別以20 g·L－1的甘油、甘露醇、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、果糖、微晶纖維素、可溶性淀粉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源。氮源優(yōu)化分別以4 g·L－1的酵母膏、蛋白胨、硫酸銨、尿素和硝酸鉀代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源。無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化分別以0.5 g·L－1的NaCl、 KCl、 CaCl2、 MgCl2、 FeSO4、 Fe2（SO4）3、 ZnCl2、CuSO4、MnCl2代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為無(wú)機(jī)鹽。營(yíng)養(yǎng)因子優(yōu)化分別以 10 mg·L－1的 VB1、 VB2、 VB6、 VB12、 VC 和 3,5－二硝基水楊酸為營(yíng)養(yǎng)因子。pH優(yōu)化分別選擇pH5、pH5.5、pH6、 pH6.5、 pH7、 pH7.5代替自然 pH。 分別比較不同的單因素，篩選出具有高糖耗量發(fā)酵液的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、營(yíng)養(yǎng)因子和pH。

1.4.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了確定最優(yōu)的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和營(yíng)養(yǎng)因子，設(shè)計(jì)了L18（37）正交試驗(yàn)，配成18種培養(yǎng)基，在250 mL三角瓶中裝入培養(yǎng)液100 mL，每種設(shè)置3個(gè)重復(fù)，按照10%接種， 28℃、 160 r·min－1培養(yǎng) 5d， 測(cè)定糖耗量。

1.4.4 糖耗量測(cè)定方法

（1）發(fā)酵液的制備

發(fā)酵液離心 （4 000 r·min－1， 10 min）， 取上清液備用。

（2）離體肝組織的制備

試驗(yàn)小鼠 （昆明種雄性小鼠，6周齡，體重18 g～20 g，由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）乙醚麻醉后取肝臟組織， 4℃條件下研磨離心 （4 500 r·min－1， 10 min），取上清液備用。

（3）糖耗量的計(jì)算方法

3,5－二硝基水楊酸比色測(cè)糖法[13，14]，測(cè)定發(fā)酵液中的還原糖含量A1。

取 0.5 mL 發(fā)酵液， 0.5 mL 肝臟上清液， 加入 pH7.4的 0.2 mol·L－1磷酸鹽緩沖液 1 mL， 同時(shí)加入 2%葡萄糖（A0）和10 mg苯甲酸鈉，定容至2 mL混勻。然后37℃水浴48 h后，用3,5－二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖含量A2。 糖耗量 （I）計(jì)算公式為

式中： A0、 A1、 A2同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 碳源對(duì)糖耗量的影響

碳源是培養(yǎng)基中的主要成分之一，能被微生物用來(lái)構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物骨架，以及為生物體生命活動(dòng)提供能量。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同碳源對(duì)發(fā)酵液糖耗量的影響

從圖1可以看出，以葡萄糖 （對(duì)照組）為碳源的發(fā)酵液糖耗量最高，為74.87%，其次是甘露醇為碳源的發(fā)酵液糖耗量為71.89%。以乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖和果糖為碳源的發(fā)酵液糖耗量相近，分別為66.33%、66.66%、69.74%、 68.37%、 67.73%。 以微晶纖維素和可溶性淀粉為碳源的發(fā)酵液糖耗量都比較低，均低于63%。可見(jiàn)，葡萄糖和甘露醇是較適合的碳源。

2.1.2 氮源對(duì)糖耗量的影響

氮源是微生物生長(zhǎng)所需要的重要物質(zhì)，主要用于合成菌體細(xì)胞物質(zhì) （氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸）和含氮代謝物。不同的微生物所需要的氮源不盡相同。結(jié)果見(jiàn)圖2。

硫酸銨和蛋白胨 （對(duì)照組）作為氮源的發(fā)酵液糖耗量最高，分別為70.75%和71.91%。尿素和硝酸鉀次之，為67.19%和 68.14%。酵母膏作為氮源的效果最差僅為64.08%，顯著低于蛋白胨 （對(duì)照組）因此，正交試驗(yàn)中確定硫酸銨和蛋白胨作為氮源。

圖2 不同氮源對(duì)發(fā)酵液糖耗量的影響

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)糖耗量的影響

無(wú)機(jī)鹽在微生物生長(zhǎng)中的主要作用是構(gòu)成菌體細(xì)胞成分，作為輔基、輔酶、抑制劑或激活劑。無(wú)機(jī)鹽參與機(jī)體內(nèi)酶活性的調(diào)節(jié)，同時(shí)無(wú)機(jī)鹽還能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓、pH、氧化還原電位等，因此無(wú)機(jī)鹽在微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中起著非常重要的作用。試驗(yàn)選擇了KCl、NaCl、MgCl2、 ZnCl2、 CaCl2、 MnCl2、 FeSO4、 CuSO4和 Fe2(SO4)3對(duì)發(fā)酵液糖耗量的影響，并以不加無(wú)機(jī)鹽作為對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵液糖耗量的影響

從圖3可以看出，添加無(wú)機(jī)鹽后糖耗量較高的是FeSO4、 KCl、 ZnCl2， 分 別 是 81.49%、 79.22%和 71.87%，均高于對(duì)照組 67.77%。 添加 MgCl2、 CaCl2、 NaCl、 Fe2(SO4)3、CuSO4、 MnCl2的發(fā)酵液糖耗量分別為 65.67%、 68.12%、65.86%、 67.61%、 56.08%、 59.28%， 均低于對(duì)照組。 最終確定FeSO4、KCl、ZnCl2作為正交試驗(yàn)中的無(wú)機(jī)鹽。

2.1.4 生長(zhǎng)因子對(duì)糖耗量的影響

生長(zhǎng)因子是體內(nèi)參與反應(yīng)催化劑重要輔酶，對(duì)酶活性起著調(diào)控作用。本試驗(yàn)選擇了維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、維生素C并以不加生長(zhǎng)因子的作為對(duì)照，測(cè)定對(duì)發(fā)酵液中糖耗量的影響。結(jié)果見(jiàn)圖4。

從圖4可以得出，加入不同生長(zhǎng)因子的發(fā)酵液糖耗量沒(méi)有明顯的區(qū)別，與對(duì)照組的71.91%接近。說(shuō)明生長(zhǎng)因子在試驗(yàn)中沒(méi)有顯著的影響。

2.1.5 pH 對(duì)糖耗量的影響

pH對(duì)菌絲體代謝的影響表現(xiàn)為對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響和對(duì)產(chǎn)物合成的影響，試驗(yàn)分別選擇 pH5、pH5.5、pH6、pH6.5、 pH7、 pH7.5， 并以自然 pH 作為對(duì)照試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵液糖耗量的影響。結(jié)果見(jiàn)圖5。

不同pH條件下，發(fā)酵液糖耗量分別為67.19%、63.81%、 51.78%、 65.22%、 66.66%、 68.97%， 但都低于作為對(duì)照的自然pH，為70.67%。因此正交試驗(yàn)選擇自然pH。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取葡萄糖、甘露醇、蛋白胨、 硫酸銨、 KCl、 FeSO4、 ZnCl2進(jìn)行正交試驗(yàn) L18（37），因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，確定各組分優(yōu)化比例。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，不同組合間發(fā)酵液糖耗量不同。各因素對(duì)發(fā)酵液糖耗量的影響大小依次為葡萄糖＞硫酸亞鐵＞甘露醇＞氯化鋅＞蛋白胨＞硫酸銨＞氯化鉀，其中碳源葡萄糖對(duì)發(fā)酵液糖耗量的影響最大，無(wú)機(jī)鹽氯化鉀的影響最小。從糖耗量來(lái)考察各因素水平值，最適培養(yǎng)基組合應(yīng)是葡萄糖 5 g·L－1、 硫酸亞鐵 0.5 g·L－1、 甘露醇 5 g·L－1、 氯化鋅 0.5 g·L－1、 蛋白胨 1 g·L－1、 硫酸銨 1 g·L－1、 氯化鉀 0.5 g·L－1。

為了證實(shí)試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，用上述最佳培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)得發(fā)酵液糖耗量為88.62%。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

3 討論與結(jié)論

肝臟是體內(nèi)各代謝的主要靶器官之一，促進(jìn)并提高肝臟的葡萄糖消耗量是糖尿病研究的重要課題。在本試驗(yàn)中，保持離體肝臟的活性是至關(guān)重要的。試驗(yàn)中加入防腐劑來(lái)保持離體肝臟的活性不受到體外環(huán)境的污染。體外反應(yīng)48 h后顯微觀察，發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有受到雜菌污染，同時(shí)反應(yīng)中的葡萄糖消耗完全。

本試驗(yàn)利用樹舌發(fā)酵液提高離體肝臟糖耗量，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到了最佳優(yōu)化培養(yǎng)基，即為葡萄糖5 g·L－1、 硫酸亞鐵 0.5 g·L－1、 甘露醇 5 g·L－1、 氯化鋅0.5 g·L－1、 蛋白胨 1 g·L－1、 硫酸銨 1 g·L－1、 氯化鉀 0.5 g·L－1。發(fā)酵后糖耗量可達(dá)到88.62%，顯著高于未優(yōu)化培養(yǎng)基的74.87%。本試驗(yàn)表明樹舌發(fā)酵液能夠促進(jìn)離體肝臟內(nèi)葡萄糖消耗，達(dá)到提高糖耗量的作用，是潛在的降糖及治療糖尿病藥物。但其降糖機(jī)理及效應(yīng)還需通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)研究證實(shí)。

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