石永利 吳鴻雁 樊祥山 張明逸 葉慶 馮振卿*

1.南京醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系，江蘇 南京 210008；

2.南京市鼓樓醫(yī)院病理科，江蘇 南京 210008

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是國內(nèi)致死率最高的惡性腫瘤。其主要治療手段是手術(shù)切除結(jié)合手術(shù)后放療和化療［1］。目前已經(jīng)通過檢測一些相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)情況來反映腫瘤的分化、增殖程度等，以指導(dǎo)臨床治療［2］。然而腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移通常是NSCLC患者死亡的主要原因，因此研究與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)志物能夠更好地判斷患者的預(yù)后情況，為NSCLC患者的分子靶向治療提供新思路［1］。研究發(fā)現(xiàn)上皮-間葉轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)是腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的一個重要原因［3-4］。本研究采用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法，檢測EMT相關(guān)蛋白Snail、Vimentin、E-cadherin和β-catenin在NSCLC中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

從南京市鼓樓醫(yī)院病理科選取2006年—2008年間石蠟包埋的NSCLC患者腫瘤組織標(biāo)本165例，患者中男性115例，女性50例；年齡36～83歲，中位年齡62歲?；颊咝g(shù)前均未接受放療和化療。按照2009年WHO肺癌組織學(xué)分類及分級標(biāo)準(zhǔn)，其中腺癌107例，鱗癌58例；中高分化117例，低分化48例；TNM分期Ⅰ期64例，Ⅱ期39例，Ⅲ期57例，Ⅳ期5例?；颊呔哂型暾碾S訪資料。

1.2 方法

1.2.1 分組

依據(jù)Snail、Vimentin、E-cadherin/β-catenin復(fù)合體的異常表達(dá)情況對患者進(jìn)行分組：組1(均無異常)、組2(僅1種異常)、組3(2種異常)和組4(3種異常)，繼續(xù)分為：EMT-L1組(1～2種異常)和EMT-L2組(3～4種異常)。

1.2.2 組織芯片的制備

復(fù)習(xí)所有患者的全部HE切片，確定有代表性的病變部位并在相應(yīng)的蠟塊上做好標(biāo)記。應(yīng)用組織微陣列打孔儀(購自美國Beecher instrument公司)在1個空白蠟塊(28 mm×22 mm×15 mm)上打孔(孔直徑1 mm，長4 mm)，然后在蠟塊的標(biāo)記部位穿刺與孔大小相同的蠟柱，準(zhǔn)確放入空白蠟塊的小孔中，依次按序操作。設(shè)計的組織陣列為14×11陣列。每個病例重復(fù)取點3次，以獲得較好的代表性。制作完成的組織芯片蠟塊4 μm連續(xù)切片50張，置于-20 ℃儲存。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色

Snail兔抗人多克隆抗體購自Abcam公司，工作濃度為1∶500。E-cadherin、β-catenin鼠抗人單克隆抗體均購自Zymed公司，工作濃度分別為1∶200和1∶150。Vimentin鼠抗人單克隆抗體購自Dako公司，工作濃度為1∶400。依照EnVision試劑盒說明書行免疫組織化學(xué)染色。PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.4 結(jié)果判定

由2名 富有經(jīng)驗的病理醫(yī)師通過雙盲法獨立評估。按腫瘤細(xì)胞染色強度進(jìn)行評分：無色為0；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。按腫瘤細(xì)胞陽性百分比評分：0為陰性；＜10%為1分；11%～50%為2分；51%～80%為3分；＞80%為4分。按照染色強度評分與陽性細(xì)胞百分比評分的乘積決定最終染色結(jié)果：其中0～3分為陰性(-)，4～12分為陽性(+)［5］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包處理。采用χ2檢驗、Spearman相關(guān)分析等統(tǒng)計學(xué)方法?；颊叩纳鏀?shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier分析，并繪制生存曲線圖，應(yīng)用Log-rank檢驗差異性。建立Cox回歸模型，對預(yù)后因子進(jìn)行多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Snail、Vimentin、E-cadherin和β-catenin的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Snail是一種轉(zhuǎn)錄因子，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色染色為陽性(圖1A)。Vimentin表達(dá)于間葉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，上皮細(xì)胞陰性。陽性結(jié)果為腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色著色(圖1B)。E-cadherin與β-catenin表達(dá)于上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜，在細(xì)胞表面形成復(fù)合物，維持細(xì)胞間的粘附功能，但在一些患者的腫瘤細(xì)胞膜上表達(dá)下調(diào)或者轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核(圖1C、D)。在165例癌組織中，Snail、Vimentin、E-cadherin和β-catenin的陽性例數(shù)分別為75(45.5%)、56(33.9%)、110(66.7%)和84(50.9%)。65(39.4%)例患者同時呈E-cadherin和β-catenin陽性表達(dá)，表明E-cadherin/β-catenin復(fù)合體完整。Snail的表達(dá)與E-cadherin的水平呈負(fù)相關(guān)(P＜0.001)，E-cadherin的表達(dá)與β-catenin呈正相關(guān)(P=0.003，表1)。Vimentin、E-cadherin和β-catenin的表達(dá)與患者年齡、性別、組織學(xué)類型、TNM分期無明顯相關(guān)性。Snail的表達(dá)與腫瘤的分化有關(guān)，低分化的NSCLC患者Snail的陽性率高于中高分化的NSCLC患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.013)。

2.2 Snail、Vimentin及E-cadherin/β-catenin復(fù)合體的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

165例NSCLC患者的平均生存時間為28個月，3年生存率為41.9%。Kaplan-Meier生存分析顯示，Snail、Vimentin陽性組的總生存期顯著短于陰性組(P=0.005 9、P=0.025 7，表2)。E-cadherin/β-catenin復(fù)合體不完整組(E-cadherin和β-catenin的表達(dá)至少1個陰性)的總生存期顯著短于完整組(E-cadherin和β-catenin的表達(dá)同時陽性，P=0.0025，表2)。

生存分析顯示，組1和組2患者之間的生存期無顯著差異，但兩組患者的生存期顯著短于組3和組4的患者，說明Snail、Vimentin及E-cadherin/β-catenin復(fù)合體其中任意2種表達(dá)異?；蛘?種表達(dá)異常組的總生存期顯著短于無異常或僅有1個異常表達(dá)組(圖2)。EMT-L2組的患者與EMT-L1組相比腫瘤的分化程度相對較差，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)。生存分析結(jié)果顯示，EMT-L2組患者的生存期顯著短于EMT-L1組的患者(P＜0.000 1，圖3A)。以此因素以及表2中患者性別、分化程度、腫塊最大徑、TNM分期及神經(jīng)侵襲為獨立變量進(jìn)行Cox回歸多因素分析。結(jié)果顯示，TNM分期、腫塊最大徑、EMT-L是獨立的風(fēng)險預(yù)后因子(表3)。在Ⅰ期NSCLC(n=64)患者中，EMT-L2組(n=24)的總生存率顯著低于EMT-L1組(n=40，P=0.0244，圖3B)，Cox多因素分析顯示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(HR=0.318；95%CI=0.116～0.867；P=0.025)。

表 1 NSCLC患者體內(nèi)Snail、Vimentin、E-cadherin和β-catenin表達(dá)的相關(guān)性Tab.1 Correlation between Snail, Vimentin, E-cadherin and β-catenin expression in patients with NSCLC

表 2 165例NSCLC患者總生存期的單因素分析Tab.2 Univariate analysis for overall survivals of 165 patients with NSCLC

表 3 165例NSCLC患者總生存期的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis for overall survivals of 165 NSCLC patients

3 討 論

EMT是指細(xì)胞由上皮表型向間葉表型轉(zhuǎn)變的過程，其重要方面之一是丟失上皮標(biāo)志物，例如c ytokeratin、E-cadherin和β-catenin等。E-cadherin是上皮細(xì)胞表面的黏附分子，對于細(xì)胞之間的黏附起到重要的作用，其下調(diào)是EMT的重要特征之一。β-catenin在細(xì)胞膜上與E-cadherin形成復(fù)合體，共同參與細(xì)胞之間的黏附作用。E-cadherin、β-catenin的表達(dá)下調(diào)常使細(xì)胞之間的黏附能力下降，轉(zhuǎn)移和侵襲能力增強。在多種腫瘤組織中如結(jié)腸癌、肺癌等也發(fā)現(xiàn)E-cadherin/β-catenin復(fù)合體的破壞，與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6-9］。本研究165例NSCLC患者，E-cadherin/β-catenin復(fù)合體在65例(39.4%)患者中完整存在。E-cadherin/β-catenin復(fù)合體不完整組的總生存期顯著短于完整組，表明E-cadherin/β-catenin復(fù)合體完整的患者預(yù)后較好。

EMT的另外一個重要方面是間葉標(biāo)記的表達(dá)，如間葉細(xì)胞表面標(biāo)志物Vimentin和調(diào)節(jié)間葉細(xì)胞分化的核轉(zhuǎn)錄因子Snail、S-100A4等。許多研究顯示，間葉蛋白的表達(dá)與腫瘤的分化程度以及細(xì)胞侵襲的表現(xiàn)型和腫瘤患者生存期縮短相關(guān)［10-13］。Snail的表達(dá)可以增加乳腺腫瘤細(xì)胞的侵襲性，在乳腺癌中其高表達(dá)與腫瘤的低分化和患者生存期縮短相關(guān)［11］。過表達(dá)Snail使胰腺腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力增強，將過表達(dá)Snail的胰腺腫瘤細(xì)胞注射入小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移能力明顯增強［14］。Snail、Vimentin陽性組的總生存期顯著短于陰性組。Snail或者Vimentin陽性的患者的預(yù)后較差，說明Snail、Vimentin異常表達(dá)的患者常常在術(shù)后易發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，生存時間較短。本研究中Snail與腫瘤的分化程度相關(guān)，中高分化的腫瘤Snail高表達(dá)，低分化的腫瘤Snail表達(dá)相對較低，這表明Snail可能在NSCLC的發(fā)生中起重要作用。

Snail的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Snail是一種核轉(zhuǎn)錄因子，通過與E-cadherin啟動子的結(jié)合而抑制E-cadherin的表達(dá)［15］。E-cadherin的表達(dá)與β-catenin呈正相關(guān)，β-catenin的膜丟失常伴隨著E-cadherin表達(dá)的降低。原因可能是當(dāng)E-cadherin丟失，E-cadherin/β-catenin復(fù)合體遭到破壞，β-catenin由細(xì)胞膜的定位轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，調(diào)節(jié)與EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)［16］。

目前許多研究已經(jīng)報道了采用一些分子標(biāo)志物能夠判斷NSCLC患者的預(yù)后和生存情況［17-18］。但是將與轉(zhuǎn)移相關(guān)的一些分子標(biāo)志物聯(lián)合起來，用來判斷NSCLC患者的預(yù)后和生存情況的研究還很少。Snail、Vimentin及E-cadherin/β-catenin復(fù)合體的異常表達(dá)是EMT過程中的重要變化，在多種腫瘤中表達(dá)異常與患者的預(yù)后有著密切的關(guān)系。本研究顯示，Snail、Vimentin及E-cadherin/β-catenin復(fù)合體EMT異常表達(dá)與NSCLC患者生存期短相關(guān)。根據(jù)每個患者這3種蛋白的改變情況，將患者分為EMT-L1組與EMT-L2組，EMT-L2組患者與EMT-L1組患者相比，其分化程度相對較低，說明當(dāng)EMT的水平越升高時，不僅使細(xì)胞之間的黏附性下降，同時對于腫瘤組織的分化程度也有一定的影響。生存分析結(jié)果顯示，EMT-L2組患者的總生存期顯著短于EMT-L1組。此因素與TNM分期和腫瘤最大徑是獨立的預(yù)后因素，因此根據(jù)患者這3種與轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白的異常表達(dá)情況，能夠?qū)颊叩纳媲闆r做出判斷，這3種蛋白中任意2種蛋白表達(dá)異常時患者的預(yù)后較差。晚期的NSCLC在手術(shù)后要接受化療，然而早期NSCLC的化療仍然存在爭議［19］。本研究也分析了此分組在Ⅰ期NSCLC患者中判斷患者生存期的作用。在Ⅰ期NSCLC患者中，EMT-L2組患者的總生存期顯著短于EMT-L1組患者。因此這3種蛋白的異常表達(dá)情況對手術(shù)后Ⅰ期NSCLC患者的治療具有指導(dǎo)意義。

綜上所述，Snail、Vimentin和E-cadherin/β-catenin復(fù)合體在NSCLC中的異常表達(dá)與患者的生存期相關(guān)。任何2種或2種以上蛋白的異常表達(dá)提示預(yù)后相對較差，是NSCLC獨立的風(fēng)險預(yù)后因子，這對于NSCLC患者的治療方式和預(yù)后判斷具有重要的參考價值。

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