朱曉靈 張麗娜 戴弘季 鄭紅 趙妍蕊 宋豐舉 陳可欣

天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所流行病室，

乳腺癌防治教育部重點(diǎn)實驗室，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實驗室，天津 300060

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，隨著生活水平的提高，我國乳腺癌發(fā)病率正以每年3%的速率遞增。其影響因素除了已經(jīng)明確的如月經(jīng)失調(diào)、生育、飲食、家族史等因素外，生物鐘基因破壞已受到廣泛關(guān)注［1］，大量流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明晝夜節(jié)律紊亂導(dǎo)致乳腺癌發(fā)病率上升［2-5］。

隱花色素-1 (cryptochrome-1，CRY1)基因?qū)儆谏镧娀蚣易?，它最早在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，起到藍(lán)光感光色素的作用，從而使得植物根據(jù)太陽周期調(diào)校其本身生物鐘。在研究哺乳動物DNA修復(fù)光解酶過程中發(fā)現(xiàn)該基因包括Cry1和Cry2，與Pers形成異源二聚體，是生物鐘基因負(fù)反饋環(huán)的主要部分［6］。近年來生物鐘基因多態(tài)性與乳腺癌易感性的關(guān)系引起國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注，本研究旨在探討生物鐘基因CRY1rs1056560 T＞G單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)。

1 資料和方法

1.1 研究對象

本研究采用大規(guī)模病例對照研究，包括1 523例原發(fā)乳腺癌患者和1 599例非腫瘤對照，均為天津女性居民。病例為2005年1月—2009年12月在天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院住院的女性乳腺癌患者；對照為同時期在該院參加健康體檢合格的婦女，并與病例按年齡頻數(shù)匹配。對病例和對照使用統(tǒng)一的調(diào)查表進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，內(nèi)容包括：人口統(tǒng)計學(xué)特征、月經(jīng)生育情況、疾病史、疾病家族史等資料。

1.2 標(biāo)本收集和基因組DNA制備

取靜脈血5 mL (清晨空腹)，所有標(biāo)本留取均獲得研究對象同意?；蚪MDNA提取采用飽和鹽析方法，紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度，分裝于4℃?zhèn)溆?，其余DNA放于-20 ℃保存。

1.3 TaqMan SNP分型

采用TaqMan SNP分型技術(shù)(ABI7500實時定量熒光PCR儀)，針對CRY1rs1056560 T＞G位點(diǎn)設(shè)計TaqMan MGB探針(ABI公司提供)。上游引物：5’-ATGTTGTTTCTAATGACAT TTCTGTGGTTTTT-3’，下游引物：5’-CATTAA GCAAATTCTCTTGCCAAGTTCT-3’。PCR反應(yīng)體積為5 μL，內(nèi)含2×TaqMan Master Mix 2.5 μL、40×探針0.125 μL、模板DNA(10 ng/μL) 2.5 μL、dH2O 1.875 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性10 min，92 ℃ 30 s，60 ℃60 s，共40個循環(huán)，以滅菌水為陰性對照。隨機(jī)抽取10%的樣品重復(fù)實驗，一致性為100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析。采用雙側(cè)χ2檢驗比較病例組和對照組一般人口學(xué)變量、主要環(huán)境危險因素及CRY1基因型分布的差異。在對照人群中檢測CRY1基因型分布的Hardy-Weinberg平衡，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。應(yīng)用單因素和多因素非條件Logistic回歸分析估計相對危險度(odds ratios，OR)及95%可信區(qū)間(confidence intervals，CI)，并按相關(guān)因素分層，分析各因素對乳腺癌發(fā)病危險的影響，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象的一般情況

本次病例對照共納入1 523例乳腺癌病例和1 599例健康對照，病例和對照按年齡匹配(P=0.877)，其他已知環(huán)境危險因素信息表見表1，病例組的月經(jīng)初潮年齡及母乳喂養(yǎng)時間顯著小于對照組(P=0.000)，初孕年齡顯著高于對照組(P=0.000)。對照組中活產(chǎn)次數(shù)顯著較病例組多(P=0.000)，而流產(chǎn)次數(shù)則較病例組少(P=0.000)，病例組中具有乳腺良性病史及腫瘤家族史者顯著多于對照組(P=0.000和0.000)，提示可能為乳腺癌的危險因素。

2.2 兩組CRY1基因型及等位基因頻率的比較

TaqMan基因分型結(jié)果見圖1。等位基因分布頻率見表2，在對照組中，CRY1基因TT型、GT型和GG型分布頻率分別為55.0%、39.3%和5.7%，符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=2.444，P=0.118)，說明對照組人群具有較好的代表性。病例組中相應(yīng)頻率分別為58.4%、35.1%和6.6%，兩組基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.394，P=0.041)。G等位基因(GT/GG)在病例和對照間分布無顯著差異(χ2=3.671，P=0.055)。

表 1 研究對象一般情況Tab.1 General distributions in breast cancers and the healthy controls

2.3 CRY1基因多態(tài)性與乳腺癌危險性的關(guān)系

單因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，相對于TT型，GT型可以顯著降低乳腺癌發(fā)病率(OR=0.839，95%CI：0.724～0.974)(表2)，G等位基因可以降低12.9%的乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(OR=0.871，95%CI：0.756～1.003)。調(diào)整年齡、初潮年齡、初孕年齡、母乳喂養(yǎng)時間、絕經(jīng)年齡、活產(chǎn)次數(shù)、流產(chǎn)次數(shù)、良性病史及腫瘤家族史后，GT型能夠降低25.7%乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(OR=0.743，95%CI：0.580～0.951)，攜帶G等位基因個體乳腺癌發(fā)病風(fēng)險降低23.2%(OR=0.768，95%CI：0.606～0.971)。

2.4 對混雜因素分層分析

本研究進(jìn)而按絕經(jīng)狀態(tài)、初潮年齡、初孕年齡、母乳喂養(yǎng)時間、活產(chǎn)次數(shù)、流產(chǎn)次數(shù)、良性病史及腫瘤家族史對CRY1基因多態(tài)性進(jìn)行分層分析(表3)發(fā)現(xiàn)，攜帶G等位基因保護(hù)作用在絕經(jīng)后婦女、初潮≥13歲、初孕≥25歲、無腫瘤家族史者、無乳腺良性病史及流產(chǎn)0～1次婦女中更加顯著(P＜0.05)。

2.5 非條件Logistic回歸分析

對初潮年齡、初孕年齡、家族史等相關(guān)因素進(jìn)行多因素非條件Logistic回歸分析(表4)，活產(chǎn)次數(shù)、流產(chǎn)次數(shù)、良性病史、家族史及CRY1雜合GT型與乳腺癌發(fā)病相關(guān)(P＜0.05)，其中乳腺良性病史及家族史為較強(qiáng)的危險因素。

表 2 CRY1基因型頻率分布及其與乳腺癌風(fēng)險的關(guān)系Tab.2 Distributions of the SNP genotypes of CRY1 gene in case and control and its relationship with the susceptibility of breast cancer

表 3 CRY1基因型頻率按混雜因素的分層分析Tab.3 The stratif i ed analysis of CRY1 gene by confounding factors

表 4 乳腺癌多因素非條件Logistic回歸分析結(jié)果Tab.4 Multivariate logistic regression analysis of susceptibility of breast cancer

3 討 論

國內(nèi)外學(xué)者多次進(jìn)行乳腺癌的流行病學(xué)研究，Ma等［7］的Meta分析認(rèn)為乳腺癌與能夠影響人體內(nèi)源性雌激素暴露水平及遺傳家族史密切相關(guān)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)初潮年齡早、孕年齡晚、母乳喂養(yǎng)時間短、流產(chǎn)次數(shù)多、有乳腺良性病史及家族史陽性為乳腺癌危險因素，而活產(chǎn)次數(shù)多則為保護(hù)因素，其中乳腺良性病史(OR=4.067，95%CI：2.779～5.950)及家族史為較強(qiáng)的危險因素(OR=3.075，95%CI：2.298～4.115)。

生物節(jié)律與乳腺癌形成的相互關(guān)聯(lián)首先在一系列流行病調(diào)查中提出。Megdal等［4］針對多項流行病學(xué)調(diào)查進(jìn)行Meta分析：長期輪換班、夜間工作以及長期工作于跨時區(qū)飛行航班的女性乘務(wù)員因晝夜節(jié)律經(jīng)常被打亂，乳腺癌的發(fā)病率較之對照組增高約48%(OR=1.48，95%CI：1.36～1.61)。流行病學(xué)數(shù)據(jù)在小鼠模型研究中也得到證實。無論外科切除SCN［8］還是慢性暴露于燈光下打亂晝夜節(jié)律(人為的將24 h晝夜變化提前8 h)［9］，植入性腫瘤生長速度都增加。就其發(fā)生機(jī)制，國內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者支持褪黑素假說［10］，乳腺癌是激素依賴性腫瘤之一，夜間光照使得褪黑素分泌減少，而褪黑素可以作用于雌激素系統(tǒng)抑制卵巢雌激素的分泌，故晝夜節(jié)律的紊亂最終導(dǎo)致雌激素分泌的增多，從而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生。

在研究生物鐘基因突變與乳腺癌危險因素關(guān)系時，Zhu等［11］首次發(fā)現(xiàn)在絕經(jīng)前的高加索婦女中，PER3的突變基因型(含有5次重復(fù)序列的純合子+雜合子)會增加乳腺癌的發(fā)病危險(OR=1.7，95%CI：1.0～3.0)。后來又連續(xù)發(fā)現(xiàn)生物鐘基因NPAS2雜合子Ala394Thr與野生型Ala394Ala相比，可以降低乳腺癌發(fā)病率(OR=0.66，95%CI：0.51～0.85)［12］，同時發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)多態(tài)性可以降低非霍其金淋巴瘤的危險性(OR=0.61，95%CI：0.47～0.80)［13］。而關(guān)于其他激素依賴性腫瘤，Chu等［14］報道生物鐘基因CRY2rs2305160 G＞C是前列腺癌發(fā)病危險因素(OR=1.7，95%CI：1.1～2.7)，并且與胰島素抵抗有協(xié)同作用(OR=4.1，95%CI：2.2～8.0)。

CRY1基因定位于12號染色體12q23.3，其蛋白產(chǎn)物與PER形成異源二聚體，反饋抑制Clock-Bmal1異源二聚體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，是生物鐘基因負(fù)反饋環(huán)的主要部分，其基因缺失或突變將導(dǎo)致生物節(jié)律發(fā)生改變。Rs1056560位點(diǎn)位于CRY1基因3’非翻譯區(qū)，真核生物mRNA 3’非翻譯區(qū)與miRNA靶序列通過Waston-Crick配對結(jié)合，影響靶基因的表達(dá)和功能介導(dǎo)的功能，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位和翻譯水平，是許多基因表達(dá)所必需的一個調(diào)節(jié)區(qū)。若3’非翻譯區(qū)單核苷酸多態(tài)性發(fā)生改變，可使基因表達(dá)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。本研究首次探討關(guān)于CRY1基因單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌易感性之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示，CRY1三種基因型在病例組和對照組分布具有顯著差異(χ2=6.394，P=0.041)，攜帶雜合GT基因型的個體患乳腺癌風(fēng)險降低25.7% (OR=0.743，95%CI：0.580～0.951)，而攜帶GG可能由于例數(shù)少，其保護(hù)作用不顯著(OR=0.929，95%CI：0.570～1.512)。至少攜帶一個G等位基因(GT/GG)的個體患乳腺癌發(fā)病風(fēng)險降低23.2%(OR=0.768，95%CI：0.606～0.971)。

本研究進(jìn)一步就混雜因素進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)攜帶G等位基因(GT/GG)保護(hù)作用在絕經(jīng)后婦女、初潮≥13歲、初孕≥25歲、無腫瘤家族史者、無乳腺良性病史及流產(chǎn)0～1次婦女中更加顯著(P＜0.05)，在活產(chǎn)次數(shù)為2的婦女中保護(hù)作用較活產(chǎn)為0～1、≥3次強(qiáng)，但尚未達(dá)到顯著水平(P=0.086)，提示rs1056560 T＞G多態(tài)性可能與環(huán)境存在相互作用。與Zhu等［12-13］報道的生物鐘基因在絕經(jīng)前婦女作用更加明顯不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)G等位基因保護(hù)作用在絕經(jīng)后婦女的保護(hù)性更加顯著，可能與研究人種不同及樣本量差異有關(guān)。本研究同時發(fā)現(xiàn)，在有腫瘤家族史和良性病史中，與TT基因型比較，GT/GG組的OR值不顯著，可能由于家族史和乳腺良性病史為乳腺癌較強(qiáng)危險因素，掩蓋了G等位基因的保護(hù)作用，也可能與分層后家族史陽性和乳腺良性病史的個體較少相關(guān)。

本研究是基于醫(yī)院的大樣本病例-對照研究(病例1 523vs對照1 599)，我們進(jìn)一步對CRY1基因多態(tài)性與生理、生育和遺傳因素等進(jìn)行多因素非條件Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)CRY1雜合基因型(GT)可以顯著降低乳腺癌發(fā)病風(fēng)險，GG型可能由于例數(shù)少，其保護(hù)作用不顯著。由于本研究缺少研究對象職業(yè)(涉及倒班)及睡眠習(xí)慣等信息，尚需在今后研究設(shè)計中進(jìn)一步完善，同時有待于不同種族人群的關(guān)聯(lián)研究及功能學(xué)研究的進(jìn)一步證實。

［1］STEVENS R G.Light-at-night, circadian disruption and breast cancer: assessment of existing evidence ［J］.Int J Epidemiol, 2009, 38: 963-970.

［2］SCHERNHAMMER E S, LADEN F, SPEIZER F E, et al.Rotating night shifts and risk of breast cancer in women participating in the nurses’ health study ［J］.J Natl Cancer Inst, 2001, 93: 1563-1568.

［3］HANSEN J.Risk of breast cancer after night- and shift work:current evidence and ongoing studies in Denmark ［J］.Cancer Causes Control, 2006, 17: 531-537.

［4］MEGDAL S P, KROENKE C H, LADEN F, et al.Night work and breast cancer risk: a systematic review and meta-analysis［J］.Eur J Cancer, 2005, 41: 2023-2032.

［5］O’LEARY E S, SCHOENFELD E R, STEVENS R G, et al.Shift work, light at night, and breast cancer on Long Island,New York ［J］.Am J Epidemiol, 2006, 164: 358-366.

［6］DUNLAP J C.Molecular bases for circadian clocks ［J］.Cell, 1999, 96: 271-290.

［7］MA H, BERNSTEIN L, PIKE M C, et al.Reproductive factors and breast cancer risk according to joint estrogen and progesterone receptor status: a meta-analysis of epidemiological studies ［J］.Breast Cancer Res, 2006, 8:43.

［8］FILIPSKI E, KING VM, LI X, et al.Disruption of circadian coordination accelerates malignant growth in mice ［J］.Pathol Biol (Paris), 2003, 51: 216-219.

［9］FILIPSKI E, LI XM, LEVI F.Disruption of circadian coordination and malignant growth ［J］.Cancer Causes Control, 2006, 17: 509-514.

［10］STEVENS RG.Circadian disruption and breast cancer: from melatonin to clock genes ［J］.Epidemiology, 2005, 16:254-258.

［11］ZHU Y, BROWN HN, ZHANG Y, et al.Period3 structural variation: a circadian biomarker associated with breast cancer in young women ［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2005, 14: 268-270.

［12］ZHU Y, STEVENS RG, LEADERER D, et al.Nonsynonymous polymorphisms in the circadian gene NPAS2 and breast cancer risk ［J］.Breast Cancer Res Treat, 2008, 107:421-425.

［13］ZHU Y, LEADERER D, GUSS C, et al.Ala394Thr polymorphism in the clock gene NPAS2: a circadian modifier for the risk of non-Hodgkin’s lymphoma ［J］.Int J Cancer,2007, 120: 432-435.

［14］CHU LW, ZHU Y, YU K, et al.Variants in circadian genes and prostate cancer risk: a population-based study in China［J］.Prostate Cancer Prostatic Dis, 2008, 11: 342-348.