熊野娟

(上海醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系，上海 201318)

復(fù)方絞股藍(lán)膠囊含有絞股藍(lán)總苷和燈盞花素，具有提高機體免疫能力、活血化瘀的功效[1]，主要用于治療口腔黏膜白斑，而口腔黏膜白斑是國際公認(rèn)最常見的口腔黏膜癌前病變。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中用紫外分光光度法進(jìn)行含量測定，為提高制劑質(zhì)量的可控性，筆者采用薄層色譜法對絞股藍(lán)進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法對燈盞花素中主要成分野黃芩苷進(jìn)行含量測定，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀，DAD檢測器;AB 204－N型電子天平、AG－135型電子天平(梅特勒上海有限公司)。野黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110842－200605);絞股藍(lán)皂苷(西安小草植物科技有限責(zé)任公司，批號為XC100301);復(fù)方絞股藍(lán)膠囊(上海第九人民醫(yī)院);硅膠G(青島海洋化工廠);乙腈、甲醇和磷酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 絞股藍(lán)定性鑒別(薄層色譜法)

稱取復(fù)方絞股藍(lán)膠囊內(nèi)容物1 g，加三氯甲烷40 mL，加熱回流5 h，棄去濾液，藥渣揮干溶劑，加水0.5 mL，攪勻濕潤后，加水飽和的正丁醇10 mL，超聲處理30 min，吸取上清液，加3倍量的氨試液，搖勻，放置分層，取上層液蒸干，殘渣加甲醇10 mL使溶解，作為供試品溶液。取不含燈盞花素的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。精密稱取絞股藍(lán)皂苷對照品2 mg，置1 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液。照2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水(15∶40∶20∶10)10℃以下放置分層的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液無干擾(圖1)。

圖1 薄層色譜圖

2.2 野黃芩苷含量測定(高效液相色譜法)

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

表1 野黃芩苷加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

圖1 高效液相色譜圖

色譜柱∶Kromasil 100－5 C18柱(150 mm×4.5 mm，5 μm);流動相∶乙腈 －0.1%磷酸(15 ∶85);檢測波長∶335 nm;柱溫∶35℃;流速∶1.0 mL/min;進(jìn)樣量∶10 μL。在此條件下，野黃芩苷與其他組分峰可達(dá)基線分離，且與相鄰色譜峰分離度大于1.5，理論板數(shù)按野黃芩苷計算均在3 000以上。

2.2.2 溶液制備

精密稱取野黃芩苷對照品9.005 0 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含野黃芩苷0.180 1 mg的對照品貯備液。精密量取貯備液10 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得野黃芩苷對照品溶液。精密稱取復(fù)方絞股藍(lán)膠囊內(nèi)容物40 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，放冷，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取缺野黃芩苷的其余處方量藥材，按所確定的制備工藝制備缺野黃芩苷的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺野黃芩苷的陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗∶分別精密吸取對照品溶液、陰性對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果表明，色譜行為良好，各色譜峰均達(dá)基線分離;供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜峰相應(yīng)的位置上檢出色譜峰，而缺野黃芩苷的陰性對照品溶液色譜中無相應(yīng)色譜峰，表明陰性對照品無干擾(圖1)。

線性關(guān)系考察∶分別精密量取對照品貯備液 1，5，10，15，20 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.2.1項下的條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)、對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=28 870.944 15X －16.489 20，r=0.999 94(n=6)。結(jié)果表明，野黃芩苷質(zhì)量濃度在0.007～0.180 0 g/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗∶取同一質(zhì)量濃度(0.180 1 g/L)的野黃芩苷對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測定，野黃芩苷峰面積的 RSD=0.09%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗∶取同一供試品溶液，在 0，2，4，6，8，10，12 h 時分別進(jìn)樣，結(jié)果峰面積積分值平均為2 059.577 56，RSD=1.4%(n=7)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗∶取同一批號的樣品5份，依法制備供試品溶液并按上述色譜條件測定。結(jié)果平均峰面積為1 905.592 36，RSD=1.5%(n=5)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗∶精密稱取對照品10.062 5 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取20 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL含0.161 0 mg的溶液。稱取已知含量的6份樣品，精密稱定，置50 mL容量瓶中，分別加入上述對照品溶液5，10，15 mL，按樣品測定法測定含量，結(jié)果見表1。

2.2.4 樣品含量測定

取復(fù)方絞股藍(lán)膠囊樣品適量，照2.2項下供試品溶液制備方法制備溶液，按上述色譜條件進(jìn)行含量測定。結(jié)果批號為20080628，20080717，20080901的3批樣品中，野黃芩苷的含量分別為7.13，7.23，7.18 mg/g，平均 7.18 mg/g，RSD 為 1.35%(n=2)。

3 討論

對絞股藍(lán)進(jìn)行薄層色譜鑒別時，比較了三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇(20∶45∶35)、三氯甲烷 －乙酸乙酯 －甲醇 －水(3∶8∶4∶2)[2]、三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇 －水(15∶40∶20∶10)3種展開劑，結(jié)果只有最后1種展開劑的下層液能使絞股藍(lán)皂苷色譜斑點與相鄰色譜斑點分離，且斑點清晰。

在對野黃芩苷的含量進(jìn)行測定時，考察了流動相和柱溫的條件，試用乙腈 － 水(35 ∶65)[3]、乙腈 －0.1% 磷酸(25 ∶75)、乙腈 －0.1%磷酸(15∶85)3種流動相，發(fā)現(xiàn)只有乙腈－0.1%磷酸(15∶85)為流動相且在柱溫為35℃時，野黃芩苷峰與相鄰色譜峰達(dá)到有效分離，且色譜行為良好。方法學(xué)考察結(jié)果表明，高效液相色譜法重復(fù)性好，精密度和回收率都較滿意，因此可作為復(fù)方絞股藍(lán)膠囊的質(zhì)量控制方法。

[1]李群峰.絞股藍(lán)的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].光明中醫(yī)，2009，24(12):2 396 －2 397.

[2]王瑞雪，王樹華，王建輝，等.長梗絞股藍(lán)皂苷B的分離[J].華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，10(3):340－341.

[3]張轉(zhuǎn)平，王新權(quán)，胥道寶，等.HPLC法測定絞股藍(lán)中的絞股藍(lán)皂苷A的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2008，23(2):87 －88.