賈 陽(yáng)，謝予朋，靳英華

(中國(guó)人民解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，北京 100700)

生物技術(shù)藥物是指利用生物技術(shù)手段生產(chǎn)或獲得的藥物，包括基因工程藥物和基因藥物。目前除生物芯片及基因檢測(cè)領(lǐng)域由于實(shí)際投資較晚且正處于前期研發(fā)階段，尚未實(shí)現(xiàn)凈收益外，其他生物技術(shù)領(lǐng)域均已實(shí)現(xiàn)凈收益，其中基因工程藥物領(lǐng)域累計(jì)實(shí)現(xiàn)的凈收益最高，在整個(gè)生物領(lǐng)域占到63% 的市場(chǎng)份額。傳統(tǒng)的藥物主要是化學(xué)小分子，生物利用度較好，而現(xiàn)代的基因藥物和蛋白質(zhì)藥物大多數(shù)是生物大分子，穿透能力低。因此，隨著生物技術(shù)藥物的發(fā)展，其劑型研究迫在眉睫。

1 基因工程藥物的劑型研究

1.1 概述

基因工程藥物是指采用現(xiàn)代生物技術(shù)(如采用DNA重組技術(shù)或其他生物新技術(shù))借助某些微生物、植物或動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)所需的藥品。目前臨床使用的基因工程藥物的主要?jiǎng)┬途鶠槿芤盒妥⑸鋭┖蛢龈煞坩槃?，因其為生物蛋白，體內(nèi)極易被蛋白酶降解，故需反復(fù)注射給藥，給臨床帶來(lái)了不方便。對(duì)基因工程藥物進(jìn)行劑型改造，現(xiàn)階段普遍采用生物可降解高分子材料對(duì)藥物進(jìn)行包裹，以增強(qiáng)其穩(wěn)定性并達(dá)到控釋緩釋的效果[1]，另外還可將材料進(jìn)行靶向性修飾而使藥物具有靶向性。

1.2 納米脂質(zhì)體、納米囊、納米球和共聚物材料

納米脂質(zhì)體、納米囊、納米球通常由聚乳酸、聚丙交酯－乙交酯、殼聚糖、明膠等生物可降解高分子材料包裹藥物，可形成各種粒徑不超過(guò)100 nm的膠束，其具有納米材料的特性。生物可降解材料可以用于口服、靜脈注射和肌肉注射，非生物可降解材料只能用于口服。聚合物膠束是近幾年正在發(fā)展的一類新型納米載體。構(gòu)成嵌段共聚物親水區(qū)的主要是聚乙二醇，疏水區(qū)常用聚氧乙烯、聚苯乙烯、聚氨基酸及聚己內(nèi)酯等聚酯類，它們與聚乙二醇一起構(gòu)成兩性聚合物。

1.3 海綿體外用劑型

近年有人以Ⅰ型膠原蛋白、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(acid fibro－blast growth factor，aFGF)為主要原料制備酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子復(fù)合膠原海綿體[2]。將aFGF配制成50 μg/mL的溶液，過(guò)濾除菌;將制備的Ⅰ型膠原蛋白溶液用0.05 mol/L的NaH溶液調(diào)pH至6，然后與aFGF溶液按照1∶1體積比混合，倒入模具中，經(jīng)過(guò)冷凍干燥成海綿體，即得aFGF膠原海綿。再進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，包括急性毒性試驗(yàn)、刺激性試驗(yàn)、致敏試驗(yàn)、溶血性試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及動(dòng)物體內(nèi)埋植試驗(yàn)，結(jié)果證明，aFGF膠原海綿的毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果均呈陰性，在兔肝埋植試驗(yàn)中未見異常反應(yīng)，8周內(nèi)降解;在臨床上選取開放性創(chuàng)面進(jìn)行貼敷，證明臨床應(yīng)用具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合、阻止?jié)B液溢出的效果。

2 基因藥物的藥物遞送系統(tǒng)研究

2.1 概述

基因藥物是將治療基因接到病毒或非病毒性載體中輸入體內(nèi)進(jìn)行治療的藥物?；蛩幬锏难芯渴轻槍?duì)功能基因組和基因轉(zhuǎn)錄本mRNA兩類生物大分子中人體異常表達(dá)的致病基因，以及外源致病微生物基因進(jìn)行基因治療。基因核酸藥物制劑研究開始于20世紀(jì)70年代中期，從第一個(gè)反義核酸藥物Vitrovene于1998年和1999年相繼在美國(guó)和歐洲上市[3]以來(lái)，目前全球已有近30個(gè)藥物和治療方案進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

Verma[4]強(qiáng)調(diào)，基因治療的關(guān)鍵在于基因遞送系統(tǒng)。目前，廣泛使用的基因遞送系統(tǒng)可分為病毒與非病毒基因遞送系統(tǒng)。病毒基因遞送系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染率高，但存在野生型感染，尤其是最近發(fā)生的基因治療致患者死亡事件，使得人們對(duì)病毒基因遞送系統(tǒng)的選擇更加慎重。因此，非病毒基因遞送系統(tǒng)是未來(lái)的發(fā)展方向。但一般非病毒載體轉(zhuǎn)染效率低，因?yàn)榛蛩幬锓肿恿看笄冶砻鎺ж?fù)電、親水性過(guò)強(qiáng)而不易通過(guò)細(xì)胞膜[5]，且易被核酸酶降解。開發(fā)穩(wěn)定的、具有一定親水親油平衡、透過(guò)性好，尤其是直接靶向的非病毒基因藥物載體，對(duì)于改善基因藥物治療尤為關(guān)鍵。

2.2 受體介導(dǎo)靶向性非病毒基因遞送系統(tǒng)

常見用于靶向的配體及其靶向的特異性細(xì)胞對(duì)應(yīng)關(guān)系見表1。受體靶向的機(jī)制是基因通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑(receptor mediated endocytosis)進(jìn)入細(xì)胞。其中去唾液酸糖蛋白受體具有高親和力，因此對(duì)非病毒載體的糖基化修飾在基因靶向治療中研究較多，最具有開發(fā)前景。

表1 常見用于靶向的配體及其靶向的特異性細(xì)胞

1)糖基化修飾的陽(yáng)離子脂質(zhì)體基因遞送系統(tǒng)

陽(yáng)離子脂質(zhì)體通常由1個(gè)單一的陽(yáng)離子兩親化合物和1個(gè)中性輔助脂組成，前者又稱為細(xì)胞轉(zhuǎn)染素(cytofectin)，是陽(yáng)離子脂質(zhì)體的活性中心和關(guān)鍵部位。細(xì)胞轉(zhuǎn)染素的基本結(jié)構(gòu)是1個(gè)帶正電荷的頭基團(tuán)(親水基團(tuán))連接在1個(gè)疏水基團(tuán)上，頭基團(tuán)一般是帶有1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基的長(zhǎng)鏈胺類基團(tuán)，疏水基團(tuán)則主要有脂肪酰鏈和膽固醇環(huán)兩類。中性或兼性輔助脂(colipid)與之結(jié)合的目的是穩(wěn)定雙層膜和降低陽(yáng)性成分的毒性，其中二油酰磷脂酰乙醇胺是應(yīng)用最廣的中性磷脂。Hara等[6]報(bào)道，去唾液酸脂球蛋白質(zhì)修飾的脂質(zhì)體DNA復(fù)合物，可通過(guò)去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑被體外培養(yǎng)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞攝取。采用預(yù)先給予乙二胺四乙酸和門靜脈注射給藥的方法，基因表達(dá)在肝臟中最強(qiáng)。

由于在陽(yáng)離子脂質(zhì)體中引入去唾液酸糖蛋白非常煩瑣，用低相對(duì)分子質(zhì)量的糖基(半乳糖基)修飾，方法簡(jiǎn)單且減少了免疫原性，具有更大的優(yōu)勢(shì)。Mitsuru等[7]在此基礎(chǔ)上合成了一系列新型膽固醇衍生物。此類衍生物帶有正電荷，可與DNA結(jié)合，半乳糖基或甘露糖基可通過(guò)去唾液酸糖蛋白受體或甘露糖受體靶向于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞或肝巨噬細(xì)胞。由于肺部第一毛細(xì)血管床(the first capihary bed)的截留效應(yīng)，未被糖基修飾的脂質(zhì)體主要在肺部被非目的組織攝取，而糖基化修飾的上述脂質(zhì)體可通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞或巨噬細(xì)胞中均具有較高的攝取率及轉(zhuǎn)染活性，且對(duì)細(xì)胞的毒性較低。

2)糖基化修飾的陽(yáng)離子聚氨基酸基因遞送系統(tǒng)

目前聚賴氨酸(poly－lysine，PLL)被廣泛用作載體的骨架。陽(yáng)離子聚賴氨酸與帶負(fù)電的成分通過(guò)靜電結(jié)合(降低DNA負(fù)電性的同時(shí)攜帶其透膜)形成復(fù)合物后，進(jìn)行糖基化修飾，即能進(jìn)行受體介導(dǎo)的靶向性治療。腫瘤細(xì)胞表面的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、葉酸受體均過(guò)度表達(dá)[8－9]，因此可通過(guò)采用上述合適的配體對(duì)非病毒基因遞送系統(tǒng)進(jìn)行修飾，以實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的靶向治療。如聚賴氨酸與內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體特異性抗體通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)合可形成用于腫瘤基因治療的靶向性載體[10]。

3)糖基化殼聚糖基因遞送系統(tǒng)

殼聚糖是甲殼類動(dòng)物中的甲殼素脫乙?；蟮玫降亩嗵穷愇镔|(zhì)，作為基因給藥系統(tǒng)的最大特點(diǎn)是安全性高、無(wú)免疫原性、生物可降解。通過(guò)對(duì)殼聚糖進(jìn)行糖基化修飾，可提高其轉(zhuǎn)染效率。殼聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量會(huì)影響粒子的大小、復(fù)合物的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染率。當(dāng)殼聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量為40 000時(shí)，復(fù)合物的轉(zhuǎn)染率較高。

4)含有核定位信號(hào)的非病毒基因遞送系統(tǒng)

基因藥物經(jīng)過(guò)膜受體介導(dǎo)、靶向內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，最終目的是要進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的校正，從而達(dá)到治療目的。細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，核膜是基因入核的主要屏障。核孔復(fù)合物的孔徑一般為9 nm，相對(duì)分子質(zhì)量小于20 000～40 000或粒徑小于9 nm的物質(zhì)可通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入核內(nèi)，而大分子如基因則要通過(guò)核孔復(fù)合物(nuclear proe complexes)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)入核內(nèi)。在核定位信號(hào)(nuclear localization signals)介導(dǎo)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，核孔復(fù)合物的孔徑可增加到26 nm[11]。值得注意的是，將核定位信號(hào)與非病毒載體如聚賴氨酸連接并不能提高基因的轉(zhuǎn)染效率，說(shuō)明核定位信號(hào)的作用在胞內(nèi)而非細(xì)胞膜表面。Tachibana等[12]通過(guò)增加核定位信號(hào)，已成功地將牛血清白蛋白靶向于細(xì)胞核。

2.3 受體介導(dǎo)靶向性非病毒基因遞送系統(tǒng)陽(yáng)離子電荷屏蔽修飾

上述非病毒基因載體使用陽(yáng)離子載體過(guò)量形成表面帶正電荷的復(fù)合物，在血液中可引起非特異性的清除和毒副作用，因此對(duì)載體表面陽(yáng)離子進(jìn)行電荷屏蔽也顯得十分重要?，F(xiàn)研究最多的、效果最好的是以聚乙二醇進(jìn)行的修飾。聚乙二醇為一電荷中性多聚物，用其對(duì)DNA/靶向性配體修飾的載體復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，可降低或屏蔽復(fù)合物所帶的電荷性。其制備的最佳方法為，先將靶向性配體修飾結(jié)合聚乙二醇，然后將聚乙二醇與所選用的非病毒載體進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，形成配基－聚乙二醇－載體復(fù)合物，最后與DNA濃縮形成復(fù)合物。該方法較其他方法可更快速、更容易地形成聚乙二醇修飾的DNA復(fù)合物[13]。

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