朱未名 虞海萍 林長(zhǎng)闖 胡海燕

(溫州市鹿城區(qū)精神病醫(yī)院，浙江 溫州 325003)

阿爾茨海默病(AD)是老年人的常見(jiàn)病、多發(fā)病。其首要癥狀是智力、記憶力、感官定向能力、判斷力、語(yǔ)言思維能力不可逆的進(jìn)行性退化，并常伴有性格改變。其病理特征為:神經(jīng)元外的β-淀粉樣蛋白(Aβ)聚集形成老年斑(SP)，神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白異常聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)，腦皮質(zhì)、海馬膽堿能神經(jīng)元及其突觸大量丟失，累及皮層動(dòng)脈和小動(dòng)脈出現(xiàn)血管淀粉樣變性。從基因多態(tài)性角度來(lái)審視本病成為重要的研究思路。人們發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的與AD相關(guān)的基因，使其在預(yù)測(cè)和治療AD方面起到積極的作用。本研究旨在探討溫州地區(qū)AD病人的精神行為特征與載脂蛋白E(ApoE)基因之間的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

1.1.1 病例收集 2009年2至12月在溫州市3個(gè)社區(qū)里對(duì)60歲以上老人進(jìn)行篩查，篩選出AD患者51例，選擇同社區(qū)非AD老年人54例進(jìn)行對(duì)照。AD組男20例，女31例，年齡60～90〔平均(71.34±7.34)〕歲，其中文盲18例，小學(xué)13例，初中14例，高中4例，大學(xué)2例。簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查(MMSE)評(píng)分(10.4±7.9)分，日常生活活動(dòng)能力量表(ADL)評(píng)分(61.3±17.2)分。對(duì)照組54例，男21例，女33例，平均年齡(70.68±8.65)歲。其中文盲11例，小學(xué)15例，初中18例，高中6例，大學(xué)4例。MMSE評(píng)分(26.2±3.2)分，ADL評(píng)分(27.3±6.9)分。AD組與對(duì)照組之間無(wú)任何血緣關(guān)系，所有患者居住溫州1年以上。各組間患者的性別、年齡分布、病程比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 采用DSM-IV-RAD關(guān)于AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)和老年性癡呆和相關(guān)疾病學(xué)會(huì)(NINCDS-ADRDA)的可能AD標(biāo)準(zhǔn)〔1〕，MMSE評(píng)分為13～24分的輕、中度癡呆患者;年齡≥50歲的男性或絕經(jīng)后的女性;Hachinski缺血指數(shù)＜4分;無(wú)重大軀體疾病;排除腦外傷、抑郁性障礙、研究前1個(gè)月使用精神藥物或血管活性藥物者。

1.2 認(rèn)知功能及精神行為檢查 包括MMSE、ADL、阿爾茨海默病行為病理評(píng)定量表(BEHAVE-AD)。其中BEHAVE-AD對(duì)AD患者2 w精神行為進(jìn)行評(píng)定，共有25條項(xiàng)目，按7個(gè)分量統(tǒng)計(jì):偏執(zhí)和妄想觀念、幻覺(jué)、行為紊亂、攻擊行為、日夜節(jié)律紊亂、情感障礙、焦慮和恐懼。收集符合上述AD診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者及60歲以上正常對(duì)照者，分別進(jìn)行抽血檢查。AD患者由二名精神科醫(yī)師進(jìn)行診斷評(píng)價(jià)，評(píng)定認(rèn)知功能、情感行為障礙，資料存檔。

1.3 ApoE基因檢測(cè)

1.3.1 DNA提取 抽取5 ml全血，EDTA抗凝，采用苯酚-氯仿法抽提基因組DNA。

1.3.2 ApoE基因的PCR擴(kuò)增 根據(jù)引物設(shè)計(jì)基本原則與已知ApoE基因序列，采用以下引物(由上海生工生物技術(shù)公司合成)，P1:5'ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC3';P2:5'TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA3'。PCR反應(yīng)體系:總體系30 μl，基因組 DNA 2 μl，10 × Buffer(含鎂)3 μl，4 × dNTP 2 μl，上游及下游引物各1 μl，TaqDNA 聚合酶0.2 μl，無(wú)菌雙蒸水21μl。PCR反應(yīng)條件:97℃預(yù)變性5 min，然后按95℃變性1 min，67℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)，最后進(jìn)一步72℃延伸7 min，4℃保存。所得產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，紫外光下呈現(xiàn)265 bp特異PCR擴(kuò)增片段。

1.3.3 ApoE基因型鑒定 在8μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入0.5μl限制性內(nèi)切酶HhaⅠ (寶生物公司)，10倍緩沖液1μl，無(wú)菌雙蒸水0.5μl，37℃保溫6 h。酶切產(chǎn)物加入8%聚丙烯酰胺凝膠板樣品槽中，8 V/cm電壓下垂直電泳1.5 h后，溴化乙錠染色，紫外光下觀察，根據(jù)電泳帶型確定ApoE的基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，ApoE基因型和等位基因頻率以百分率(%)表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 AD組精神行為障礙與ApoE基因型頻率比較 AD組精神行為障礙分7個(gè)分量統(tǒng)計(jì)，主要包括偏執(zhí)妄想觀念、幻覺(jué)、行為紊亂、攻擊行為、日夜節(jié)律紊亂、情感障礙、焦慮和恐懼等方面。在ApoE的基因型中ε4/4在偏執(zhí)和妄想觀念、幻覺(jué)及行為紊亂、攻擊方面與其他基因型有差異(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 AD精神行為障礙與ApoE基因型頻率比較〔n(%)〕

2.2 AD組與對(duì)照組ApoE基因頻率分布 共檢出ApoE基因型有 ε2/2、ε2/3、ε3/3、ε2/4、ε3/4、ε4/4，AD 組與對(duì)照組 ApoE基因型頻率分布比較 ε2/3、ε3/4、ε4/4有差異(P ＜0.05)。等位基因兩組比較ε2、ε4有差異(P＜0.05)。見(jiàn)表2，表3。

表2 AD組與對(duì)照組ApoE基因型頻率分布〔n(%)〕

表3 AD組與對(duì)照組的等位基因頻率分布〔n(%)〕

3 討論

ApoEε4被認(rèn)為是AD的危險(xiǎn)因素，可以影響AD的發(fā)病時(shí)間，ε4 的危險(xiǎn)效應(yīng)與年齡、性別相關(guān)〔4〕。陳等等〔5〕對(duì)中國(guó)漢族人群中160例散發(fā)性AD患者和195例正常對(duì)照組老年人ApoE基因多態(tài)性分布的差異進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，ApoE三種等位基因 ε2、ε3和 ε4的頻率在 AD組和對(duì)照組分別為0.056、0.713、0.231 和 0.082、0.844、0.074。ApoE 等位基因攜帶個(gè)體患AD的危險(xiǎn)為非攜帶個(gè)體的3.82倍。麥以成等〔6〕對(duì)廣東佛山地區(qū)88例晚發(fā)AD及97例正常老年人ApoE基因多態(tài)性進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明，ε4基因頻率 AD患者為0.188，正常老年人為0.082，并與晚發(fā)AD呈正相關(guān)。本文研究結(jié)果也證實(shí)了ε4基因在AD發(fā)病中起重要作用。

ApoE基因與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及智力障礙有關(guān)。張?jiān)S來(lái)等〔7〕的結(jié)果提示，AD患者在偏執(zhí)和妄想、幻覺(jué)、行為紊亂和攻擊行為等方面與正常對(duì)照組比較差異顯著，而ApoE基因檢查結(jié)果顯示攜帶ApoEε4基因的AD患者精神行為障礙更為明顯。對(duì)AD患者執(zhí)行功能障礙與ApoE基因相關(guān)性的研究結(jié)果顯示，AD患者的記憶、執(zhí)行功能、計(jì)算力較健康對(duì)照組有明顯差異，而攜帶ε4基因型者認(rèn)知功能損害更明顯〔8〕。任艷峰等〔9〕結(jié)果表明，ApoEε4 與 ApoEε2 基因均與認(rèn)知有關(guān)，其中ApoEε4基因是輕度認(rèn)知障礙的可疑危險(xiǎn)因素，而ApoEε2可能是降低輕度認(rèn)知障礙危險(xiǎn)性的因素。

ApoE基因可能影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)和智力。在對(duì)ApoEε4基因缺失的純合子和雜合子鼠在Morris迷宮中進(jìn)行空間學(xué)習(xí)能力測(cè)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，純合子鼠無(wú)此學(xué)習(xí)能力，而雜合子鼠則無(wú)任何困難。Raber等的研究發(fā)現(xiàn)ApoEε4同ApoEε2及ApoEε3相比增加了對(duì)認(rèn)知損害的危險(xiǎn)性〔10〕。海馬及毗鄰皮質(zhì)區(qū)對(duì)ApoEε4基因的損傷作用有較強(qiáng)的易感性，攜帶ε4基因的非癡呆老年人在言語(yǔ)學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中得分比未攜者低〔11〕。ApoE基因影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)及人類(lèi)智力的機(jī)制可能是多方面的。首先ApoE與中樞膽堿能系統(tǒng)功能有關(guān)。其次ApoE與神經(jīng)突觸的整復(fù)有關(guān)。ApoEε4等位基因與AD病人海馬萎縮有關(guān)，它可能在AD的病理機(jī)制中扮演了一定的角色。本研究也表明AD組精神行為障礙明顯，通過(guò)BEHAVE-AD量表分7個(gè)分量測(cè)評(píng)，主要包括偏執(zhí)妄想觀念、幻覺(jué)、行為紊亂、攻擊行為、日夜節(jié)律紊亂、情感障礙、焦慮和恐懼。結(jié)果表明，在ApoEε4的基因型中ε4/4在偏執(zhí)和妄想觀念、幻覺(jué)及行為紊亂、攻擊方面與其他基因型有差異。

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