梁起保 薛 茜 趙秀芳 石會娟 鄒玉安

(河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000)

腦血管疾病是我國位居第三的致死因素，其中缺血性腦血管病(ICVD)可占56.6% ～80%，患者總?cè)藬?shù)可達(dá)(500～600)萬，存活者有約75%的高致殘率〔1〕。本實(shí)驗(yàn)通過觀察經(jīng)驗(yàn)方康腦液2號對腦缺血再灌注(I/R)大鼠的治療作用，并從促血管新生的角度研究其治療機(jī)制，為其防治ICVD提供理論依據(jù)，也為補(bǔ)氣活血法治療老年腦梗死提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 康腦液2號:黃芪、當(dāng)歸、川芎、三七、葛根、地龍、丹參、鉤藤(后下)等組成(購于河北北方學(xué)院第一附屬醫(yī)院)。冷水浸泡一夜，煎煮2次，濾出藥渣，將2次煎取的藥液混勻，文火分別濃縮成400%、200%、100%康腦液2號(每 ml含生藥 4、2、1 g)，4℃冰箱保存。多聚甲醛(購自美國Sigma公司)。MCAO栓線(北京沙東)，兔抗大鼠 Ang-1、VEGF、CD105一抗體及相應(yīng)二抗(武漢博士德公司)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 電腦生物組織包埋機(jī)(浙江金華科迪)，石蠟切片機(jī)(美國Thermo)，電腦生物組織攤烤片機(jī)(浙江金華科迪)，光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUSBX60型)，顯微攝影裝置(日本NIKON)，自動(dòng)脫水機(jī)(美國Thermo)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 SPF級雄性SD大鼠150只，體重200～280 g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心〔許可證號SCXK(京)2006-0008〕。隨機(jī)分為:假手術(shù)組、模型組、康腦液2號高(28.6 g·kg－1·d－1)、中(14.3 g·kg－1·d－1)、低(7.15 g·kg－1·d－1)劑量組，每組24只，手術(shù)組缺血2 h，從手術(shù)后12 h開始灌胃給藥，每天1次，直至處死。給藥劑量按大鼠與人體表面積等效劑量折算，假手術(shù)組及模型組灌胃等體積生理鹽水。根據(jù)改良Longa方法，線栓經(jīng)右側(cè)頸外動(dòng)脈插線建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)法制作大腦I/R模型。

1.4 大鼠神經(jīng)功能評分 參照Longa 5分制評分方法對各個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評分。分別于大鼠蘇醒時(shí)及I/R 24 h后進(jìn)行評分:0分，無神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀;1分，不能完全伸展對側(cè)前爪;2分，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分，向?qū)?cè)傾斜;4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.5 HE染色及VEGF、Ang-1蛋白檢測 于再灌注每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取每組另外6只大鼠，10%水合氯醛(300 mg/kg)ip麻醉，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，依次灌入生理鹽水150 ml、4%多聚甲醛200 ml前固定至肢體變硬，開顱取腦，于前囟前2 mm至前囟后3 mm切腦，切塊厚度5 mm，置入4%多聚甲醛中后固定12～24 h，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。切片3μm，HE染色觀察腦梗后病理變化，采用免疫組織化學(xué)(SP二步法，按說明操作)檢測VEGF及Ang-1蛋白表達(dá)。

1.6 血管密度檢測 免疫組織化學(xué)方法標(biāo)記CD105顯示新生血管，步驟同上。切片經(jīng)圖像分析儀分析系統(tǒng)處理，參照Weidner法〔2〕進(jìn)行微血管密度(MVD)計(jì)數(shù)，每份標(biāo)本均選5個(gè)高倍視野(200×)計(jì)數(shù)微血管數(shù)目后取平均值為平均微血管數(shù)(MMVC)，以 MMVC/mm2表示 MVD(200×/高倍視野等于0.042 6 mm2)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較用SNK法。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能評分比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能行為評分顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，康腦液2號治療組大鼠顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，但是顯著高于假手術(shù)組，康腦液2號高中劑量組顯著低于低劑量組(P＜0.05)，但高中劑量兩組無顯著差異(P＞0.05)，見表1。

2.2 各組大鼠HE改變 光鏡下可見模型組梗死明顯，梗死主要位于基底節(jié)、皮質(zhì)下白質(zhì)和皮層，缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，殘存神經(jīng)細(xì)胞胞體縮小變性，細(xì)胞核固縮，胞質(zhì)深伊紅染色，神經(jīng)元纖維疏松，間質(zhì)水腫明顯，血管減少?？的X液2號治療組可見梗死范圍縮小，水腫程度也較輕，神經(jīng)元形態(tài)改變較輕，胞體完整，突起較清楚，基本保持完整。血管較模型組明顯增多。見圖1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分(n=24)和腦血管密度(n=6，血管數(shù)/mm2)比較(x±s)

圖1 各組大鼠腦病理改變(HE，×100)

2.3 腦組織VEGF及Ang-1免疫組化結(jié)果 VEGF及Ang-1陽性表達(dá)可見胞質(zhì)呈棕黃色，可表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。與假手術(shù)組相比，模型組VEGF及Ang-1蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.05或P＜0.01)。和模型組相比，康腦液2號治療組VEGF及Ang-1表達(dá)顯著增高(P＜0.05或P＜0.01)，不同的是，VEGF表達(dá)高峰在7 d，Ang-1表達(dá)高峰在14 d。康腦液2號高、中劑量治療組之間無顯著差異，但結(jié)果都明顯高于低劑量組(P＜0.05)。見表2及圖2。

圖2 各組大鼠VEGF、Ang-1和血管表達(dá)的比較(免疫組化，×400)

2.4 大鼠腦組織血管密度結(jié)果 空白組及假手術(shù)組陽性血管表達(dá)較少，模型組血管密度顯著高于空白組(P＜0.01)，與模型組相比，康腦液2號各治療組血管密度顯著增高(P＜0.05或P＜0.01)，康腦液2號高中劑量組促血管新生能力顯著強(qiáng)于低劑量組(P＜0.05)，見表1及圖2。

表2 各組大鼠VEGF和Ang-1的比較(×400，x ±s，個(gè)數(shù)/視野，n=6)

3 討論

腦缺血缺氧后出現(xiàn)一系列變化，包括炎癥反應(yīng)、自由基超載、毒性氨基酸釋放等，神經(jīng)功能和腦組織病理改變是最直接客觀的改變。但腦缺血缺氧的一系列改變歸根結(jié)底是腦組織缺血導(dǎo)致，如果能及時(shí)恢復(fù)血供無疑是治療腦缺血的主要手段。臨床工作中早期T-PA溶栓顯示較好的臨床效果證實(shí)了這一點(diǎn)。但T-PA溶栓指征苛刻，臨床上適合溶栓的病人非常少，研究一種能促進(jìn)腦缺血周圍組織血管新生的方法成為治療ICVD的重要策略。近幾年，科學(xué)家們研究了各種治療性血管新生，包括細(xì)胞療法、蛋白療法等，但不僅價(jià)格昂貴，安全性也不可靠，中藥憑借其多靶點(diǎn)、副作用小、經(jīng)濟(jì)便宜等優(yōu)點(diǎn)成為了促血管新生的研究重點(diǎn)。

血管新生是在缺血組織已有的血管床上，內(nèi)皮細(xì)胞以牙生方式長出新支，形成血管網(wǎng)使其功能與局部需要相適應(yīng)的生物學(xué)過程，主要靠促血管新生因子來促其生成。VEGF是迄今發(fā)現(xiàn)最重要一種促血管生成因，一方面能高選擇地促進(jìn)血管內(nèi)皮的有絲分裂，進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮新生;另外，其還能增加血管內(nèi)皮通透性，使血漿大分子物質(zhì)滲透到血管的基質(zhì)中，從而為新的血管提供營養(yǎng)物質(zhì)〔2〕。Ang-1在血管新生過程中發(fā)揮著重大作用，主要機(jī)制如下:①使血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化、聚集，吸引周細(xì)胞形成新生血管;②拮抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;③促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和形成管狀結(jié)構(gòu)，加強(qiáng)VEGF等血管穩(wěn)定作用;④調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，促進(jìn)血管重塑、成熟，維持血管的完整性和穩(wěn)定性〔3〕。CD105不與大血管內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)，但對新生血管反應(yīng)性強(qiáng)，即與“活化”的內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)性強(qiáng)，而對組織中正常的靜止?fàn)顟B(tài)下的血管內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)性差〔4〕。本實(shí)驗(yàn)選擇VEGF、Ang-1、CD105作為觀察血管新生的指標(biāo)更有說服性。

ICVD隸屬中醫(yī)中風(fēng)范疇，“素體氣虛，不能行血，以致血瘀”是其主要發(fā)病理論，補(bǔ)氣活血法能夠“行氣通脈、活血化瘀”，是老年性腦梗死的主要治法?？的X液2號是臨床使用多年的經(jīng)驗(yàn)方，適合氣虛血瘀患者，由補(bǔ)氣活血的鼻祖方補(bǔ)陽還五湯按照現(xiàn)代人的特點(diǎn)化裁而來，君以大量黃芪大補(bǔ)脾胃元?dú)猓沟脷馔?，瘀去絡(luò)通，并且活血祛瘀而不傷正。當(dāng)歸善于活血養(yǎng)血，有化瘀而不傷血之妙，并和黃芪1:5配伍為當(dāng)歸補(bǔ)血湯，充養(yǎng)脈絡(luò)，是為臣藥。川芎、葛根、地龍、三七、丹參等助當(dāng)歸活血化瘀，為佐藥。鉤藤、天麻引藥上行，是為使藥，君臣佐使共奏補(bǔ)氣活血化瘀之功。補(bǔ)氣活血法促血管新生研究頗多，田兆華〔5〕等實(shí)驗(yàn)證實(shí)補(bǔ)陽還五湯能明顯增多缺血腦組織新生血管數(shù)目。劉清君等〔6〕明確了當(dāng)歸補(bǔ)血湯有明顯的促血管新生作用。其余各藥對腦梗死的治療作用均有研究，有的已經(jīng)在臨床使用，比如川芎、丹參、葛根等。

綜上，康腦液2號對腦I/R發(fā)揮較好的治療作用，其機(jī)制可能是其促進(jìn)VEGF、Ang-1等促血管新生因子的表達(dá)，而使缺血周圍區(qū)域血管新生增加。

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2 Wang YQ，Guo X，Qiu MH，et al.VEGF overexpression enhances striatal neurogenesis in brain of adult rat after a transient middle cerebral artery occlusion〔J〕.JNeurosci Res，2007;85(1):73-82.

3 劉 帥，劉學(xué)政.Ang-1/Tie2系統(tǒng)與病理性血管形成的關(guān)系〔J〕.解剖科學(xué)進(jìn)展，2010;16(1):85-8.

4 于建憲，常 宏，紀(jì) 萍.CD105、CD34及Ⅷ因子在不同生理狀態(tài)下子宮內(nèi)膜中的表達(dá)〔J〕.齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2005;20(3):189-91.

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6 劉清君，李應(yīng)東，劉彩梅，等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯超濾膜提取物對雞胚絨毛尿囊膜血管新生的影響〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008;6(4):420-1.