金洪娟 王 權(quán) 所 劍

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

機體抗腫瘤免疫應(yīng)答主要效應(yīng)細胞為T細胞，其活化需要抗原信號和協(xié)同共刺激信號雙信號的作用，共刺激信號的缺乏將導(dǎo)致T細胞不能活化或凋亡。B7-1是最主要的共刺激分子之一，而大多數(shù)腫瘤細胞均不表達或低表達B7分子，這正是腫瘤免疫逃避的機制之一。因此將共刺激分子B7-1基因?qū)肽[瘤細胞可增強其免疫原性，誘導(dǎo)宿主有效的抗腫瘤免疫效應(yīng)。本實驗主要目的是在體外建立穩(wěn)定表達mB7-1的細胞系，為其進一步抗瘤研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 動物:BALB/c小鼠，購于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物部。試劑與設(shè)備:IMDM培養(yǎng)基，反轉(zhuǎn)錄酶，TRIzol試劑，Oligo(dT)，DEPC，均購自美國 GIBCO公司;10%小牛血清購自華美生物公司;EcoRⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶購自Bochring Mannheim;pcDNA3質(zhì)粒購自Invitrogen公司;淋巴細胞分離液購自上海華精生物技術(shù)有限公司;MTT購自美國Sigma公司。

1.2 重組載體的構(gòu)建

1.2.1 mB7-1引物的設(shè)計與合成 參考GenBank報道序列自行設(shè)計mB7-1基因引物序列。B7-1基因引物序列:擴增片斷為940 bp，上游及下游分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ兩個多克隆酶切位點和起始信號ATG、終止信號TAG，上游P1:5'-AGCTGAATTCATGGCTTGCA-3';下游 P2:5'-AGCTCTCGAGCTAAAGGAAG-3'。由寶生物生物工程公司合成。

1.2.2 mB7-1目的基因的獲得 采用TRIzol試劑法提取BALB/c純系小鼠mRNA，合成為cDNA。應(yīng)用引物P1及P2進行 RT-PCR，反應(yīng)體系如下:小鼠cDNA 1 μl，引物 各1 μl，dNTP 4 μl，rTaq 酶0.5 μl，10 × Buffer 5 μl，甘油2.5 μl，石蠟25 μl，雙蒸水10 μl。循環(huán)參數(shù):94℃變性1 min，55℃退火 30 s，72℃延伸1 min，以上反應(yīng)條件進行30個循環(huán)。回收PCR產(chǎn)物及pcDNA3質(zhì)粒雙酶切(EcoRⅠ和XhoⅠ)后進行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物經(jīng)體外擴增后酶切鑒定并送交生物技術(shù)公司進行全長基因序列測定。

1.3 mB7-1轉(zhuǎn)染B16細胞 取凍存B16細胞進行復(fù)蘇與傳代培養(yǎng)，鑒定后質(zhì)粒應(yīng)用脂質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)染。48～72 h后更換培養(yǎng)基進行篩選，培養(yǎng)6～8 w，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。收集篩選陽性細胞株，提取細胞總RNA，以前述引物1、2進行RT-PCR，檢測基因水平表達，mB7-1 PCR產(chǎn)物作為陽性對照。

1.4 體外殺傷效應(yīng)的檢測 B16、轉(zhuǎn)染后mB7-1-pcDNA3-B16及pcDNA3-B16腫瘤細胞(1×105ml/L)各1 ml加入絲裂霉素 C 30 ng/ml，37℃、5%CO2孵箱中孵育45 min，洗滌后制備成細胞懸液，培養(yǎng) 36 h。收集淋巴細胞，調(diào)細胞濃度至5×106ml/L;以前述3組細胞為靶細胞，效價比為10∶1，混合培養(yǎng)16 h后加入MTT試劑10μl/孔孵育8 h。離板后棄上清，加入DMSO 100μl/孔，酶聯(lián)免疫檢測吸光度(A)。抑制率計算:抑制率=〔1-(實驗孔A值-效應(yīng)細胞對照孔A值)/靶細胞對照孔A值〕×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建 連接產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切反應(yīng)后，酶切產(chǎn)物電泳可見兩條亮帶，小片段約1 000 bp大小，大片段位于5 000 bp左右，總和約6 000 bp，符合預(yù)測結(jié)果(見圖1)。生物公司測序結(jié)果經(jīng)軟件與GenBank報告mB7-1基因序列對比分析后顯示所得目的基因序列與已報道序列一致。

2.2 mB7-1轉(zhuǎn)染B16細胞基因表達 轉(zhuǎn)染mB7-1-pcDNA3后腫瘤細胞組逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物電泳可見特異性條帶，大小與陽性對照mB7-1基因片段大小一致，轉(zhuǎn)染pcDNA3腫瘤細胞組及空白對照組未見特異性條帶產(chǎn)生(見圖2)。

2.3 殺傷活性檢測 各組細胞均誘導(dǎo)產(chǎn)生殺傷效應(yīng)，而與對照組〔B16組(36.20±1.3)%，B16-pcDNA3組(40.12±1.1)%〕比較，轉(zhuǎn)染mB7-1-pcDNA3后腫瘤細胞組的殺傷活性〔(76.09±1.5)%〕顯著高于其他兩組(P＜0.05)。

圖1 mB7-1-pcDNA3酶切鑒定結(jié)果

圖2 mB7-1基因瞬時表達

3 討論

免疫學(xué)研究關(guān)于免疫效應(yīng)細胞的雙信號學(xué)說認為T細胞活化與增殖依賴于雙信號，一是抗原遞呈細胞(APC)呈遞的抗原肽——人類白細胞抗原(HLA)復(fù)合物，由特殊T細胞抗原受體(TCR)識別，并將信號傳遞給T細胞;此信號對T細胞活化是必需的，但不引起T細胞增生和分泌細胞因子。二是共刺激信號(第二信號)，共刺激信號為T細胞抗原特異性激活所必需，決定了T細胞是活化增殖、抑或轉(zhuǎn)變?yōu)闊o反應(yīng)狀態(tài)甚至凋亡〔1〕。B7-1分子存在于活化的B細胞、T細胞、樹突狀細胞及IFN-γ活化的單核細胞表面，其受體為CD28/CTLA4，表達于T細胞表面〔2，3〕。CD28與 B7-1結(jié)合，啟動協(xié)同刺激信號，在提高T淋巴細胞的反應(yīng)性、誘導(dǎo)抗凋亡基因表達、增加細胞因子的分泌(尤其是IL-2)、促進T淋巴細胞與APC的結(jié)合和阻止T淋巴細胞的失能(anergy)等方面有著重要的作用，而B7-1與CTLA-4 結(jié)合則起到抑制作用〔4，5〕。Martin 等〔5〕將轉(zhuǎn) B7 基因的K1735腫瘤細胞注入未經(jīng)免疫的同系小鼠，則發(fā)生急性排斥反應(yīng)。將B7基因?qū)肽[瘤細胞，提高特應(yīng)性CTL的活性，達到殺傷腫瘤細胞的作用。

本實驗根據(jù)雙信號理論，選取共刺激分子mB7-1作為實驗對象，針對絕大多數(shù)腫瘤細胞缺乏共刺激分子這一點，期望通過彌補或增強共刺激信號表達，提高腫瘤的免疫原性，從而誘導(dǎo)或增強CTL(特異性細胞)對腫瘤細胞的免疫識別和殺傷作用。本實驗應(yīng)用基因體外合成技術(shù)獲得目的基因片段mB7-1，于體外構(gòu)建重組mB7-1-pcDNA3真核表達載體，經(jīng)酶切電泳鑒定獲得大小約1 000 bp片段，經(jīng)測序后證實與GenBank中mB7-1序列一致。此后采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染小鼠B16腫瘤細胞，經(jīng)篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，應(yīng)用RT-PCR方法獲取的基因產(chǎn)物與鑒定后的mB7-1目的基因片段大小一致，而空白對照組無對應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)，從而在基因水平證實了該細胞系存在mB7-1的表達。將該靶細胞與效應(yīng)細胞共混培養(yǎng)后，可發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)淋巴細胞活化，產(chǎn)生了有效的殺傷作用，并且mB7-1陽性組明顯高于其他兩組。實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染B7共刺激分子后可增強腫瘤細胞的免疫原性，增強體外抑瘤效應(yīng)，也驗證上述雙信號學(xué)說，表明B7共刺激分子可作為腫瘤基因治療的靶點，為下一步的抗瘤研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 Bugeon L，Dallman MJ.Co-stimulation of T cells〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2000;162(1):164-8.

2 Collins M，Carreno BM.The B7 family of ligands and its receptors:new pathways for costimulation and inhibition of immune responses〔J〕.Ann Rev Immunol，2002;20(1):29-53.

3 Judith L，Katharina GP，Peter S.Receptor and ligands implicated human T cell costimulatory process〔J〕.Immunol Lett，2010;128(2):89-97.

4 Shi T，Kennedy G，Gorski K，et al.Cooperative B7-1/2(CD80/CD86)and B7-DCcostimulation of CD4+T cells independent of the PD-1 receptor〔J〕.JExp Med，2003;198(1):31-8.

5 Manish JB，Victor PC，Gordon JF，et al.Interaction of human PD-L1 and B7-1〔J〕.Mol Immunol，2008;45(13):3567-72.