劉榮福 占鵬程 李博安

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，福建 廈門 361003)

缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是在缺氧狀態(tài)下調(diào)節(jié)機(jī)體或細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)中的一種核轉(zhuǎn)位因子〔1〕，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的各種組織細(xì)胞。HIF-1由α和β兩種亞基組成的異二聚體蛋白，其中α亞基受缺氧或低糖調(diào)節(jié)，在缺氧時(shí)較穩(wěn)定，活性大大增強(qiáng)〔2〕，通過(guò)與其下游的靶基因特定序列DNA結(jié)合而調(diào)控他們的轉(zhuǎn)錄和翻譯，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素(EPO)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解酶、誘導(dǎo)型 NO 合酶(iNOS)〔3〕，血管形成及糖酵解酶活性增加，使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺血缺氧環(huán)境，維持生存與發(fā)展的需要，這在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本課題成功構(gòu)建了HIF-1α過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-HIF-1 α)并轉(zhuǎn)染到前列腺癌細(xì)胞株(PC-3)，建立了pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3細(xì)胞株，為研究前列腺癌與HIF-1α提供了一個(gè)可靠工具。

1 材料與方法

1.1 材料 人PC-3、pcDNA3.1質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α由廈門大學(xué)生命科學(xué)院提供。HIF-1α鼠抗人抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自武漢博士德公司，F(xiàn)ugene轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自羅氏公司，膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽取試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA公司，細(xì)胞總RNA提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，ECL試劑盒購(gòu)自Pierce公司，胎牛血清、1640培養(yǎng)基系Gibco公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 引物合成 從Genbank檢索出HIF-1αcDNA序列，根據(jù)Primer設(shè)計(jì)軟件，HIF-1α基因上游引物:5'-CGGGATCCTCTCTAGTCTCACGAGGGGTTTCC-3';下游引物:5'-GCTCTAGAGATGCTACTGCAATGCAATGGTT-3'，兩 端 引 入BamHⅠ和XbarⅠ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增片段2.89 kb，由廣州英駿生物公司合成。

1.2.2 HIF-1α片段擴(kuò)增 采用TRIZOL試劑，裂解PC-3提取總RNA，經(jīng)RT-PCR方法(具體操作參考RT-PCR試劑盒)擴(kuò)增HIF-1α基因片段，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸4 min。循環(huán)35次。末次循環(huán)后72℃再延長(zhǎng)10 min，依照膠回收試劑盒說(shuō)明書回收擴(kuò)增片段。

1.2.3 pcDNA3.1-HIF-1α重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pcDNA3.1質(zhì)粒用BamHⅠ和XbarⅠ37℃雙酶切過(guò)夜，膠回收酶切產(chǎn)物。在15μl的連接反應(yīng)體系中，加入1.5μl 10×緩沖液，1μl T4DNA連接酶，9.5μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，3μl的pcDNA3.1載體，4℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5μα，搖勻，小量抽取質(zhì)粒(具體步驟參照質(zhì)粒抽取試劑盒)，酶切，菌落PCR、瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性重組子。

1.2.4 序列測(cè)定 由上海英駿生物公司完成。采用雙脫氧鏈末端中止法，以DNA全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定核苷酸序列，同一片段經(jīng)正反兩個(gè)方向重復(fù)測(cè)定。

1.2.5 pcDNA3.1-HIF-1α重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 中量抽提鑒定正確的pcDNA3.1-HIF-1α真核表達(dá)質(zhì)粒，純化，取培養(yǎng)于6 cm培養(yǎng)板中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3細(xì)胞經(jīng)Fugene轉(zhuǎn)染(具體操作參考Fugene轉(zhuǎn)染說(shuō)明書)。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，于倒置熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)，每孔取5個(gè)視野，取其平均值計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，計(jì)算公式為:細(xì)胞轉(zhuǎn)染率=(同一高倍鏡下綠色熒光細(xì)胞總數(shù)/同一高倍鏡下細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.6 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HIF-1α的表達(dá)鑒定 Western印跡檢測(cè)HIF-1α蛋白表達(dá)情況。取轉(zhuǎn)染48 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3和pcDNA3.1-PC-3細(xì)胞，快速裂解法裂解細(xì)胞，13 000 r/min，30 min，4℃，用 Bradford法取上清液測(cè)蛋白濃度，按上樣量一致加樣，均為80μg，于8%的SDSPAGE 電泳，120 V，90 min，電泳完后轉(zhuǎn)膜，300 mA，90 min，將膜置于5%的牛奶中室溫封閉60 min，4℃兔抗人HIF-1α多克隆抗體(稀釋度為1∶1 500)雜一抗過(guò)夜，TBST洗膜10 min×3次，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG(稀釋度為1∶5 000)雜二抗60 min，Tris緩沖鹽水(TBST)洗膜10 min×3次，ECL顯影，曝光。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α擴(kuò)增片段 PC-3細(xì)胞內(nèi)抽提的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)PCR合成儀擴(kuò)增HIF-1α片段，瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)一條大小約2900bp的條帶，見(jiàn)圖1。

2.2 菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆 4℃連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鋪板，挑取連接后的菌落采用PCR方法擴(kuò)增HIF-1α片段，結(jié)果能擴(kuò)增2.89kbp大小的片段的菌落為陽(yáng)性克隆，即為連接有HIF-1α片段的重組質(zhì)粒，見(jiàn)圖2。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 菌落PCR

圖3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HIF-1α酶切鑒定

2.3 HIF-1α重組質(zhì)粒的酶切鑒定 取pcDNA3.1-HIF-1α陽(yáng)性克隆小量制備質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和XbarⅠ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳，所得結(jié)果與pcDNA3.1載體和HIF-1α片段大小一致，約5.3kbp和2.89kbp，經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)HIF-1α擴(kuò)增片段與Genebank公布一致。見(jiàn)圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌效率為(43.24±2.56)%，綠色熒光蛋白表達(dá)情況，見(jiàn)圖4。

2.5 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HIF-1α的表達(dá)鑒定 在pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，而在pcDNA3.1-PC-3細(xì)胞內(nèi)條帶較pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3弱，表明重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-HIF-1α在前列腺癌細(xì)胞內(nèi)能夠表達(dá)。見(jiàn)圖5。

圖4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞48h綠色熒光蛋白表達(dá)情況

圖5 PC-3細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)情況

3 討論

腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖能力，在其發(fā)展過(guò)程中局部腫瘤組織生長(zhǎng)超過(guò)周圍血管生長(zhǎng)速度，必然導(dǎo)致局部組織缺血缺氧，在該種缺氧情況下會(huì)誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核與HIF-1β結(jié)合，然后與其下游的靶基因的缺氧反應(yīng)元件(HRE)的HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，促使VEGF表達(dá)及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解酶活性增加，血管形成及能量代謝增強(qiáng)，維持腫瘤細(xì)胞的生存和發(fā)展。此外，近幾年研究還發(fā)現(xiàn)，HIF-1α過(guò)表達(dá)能抑制細(xì)胞凋亡〔4〕、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)〔5〕，影響腫瘤分裂以及干擾生長(zhǎng)因子〔6〕合成與分泌，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等多種途徑增強(qiáng)腫瘤生存能力。Zhong〔7〕研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌組織和癌前病變及癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病灶中HIF-1α均有不同程度的高表達(dá)，而在正常的前列腺組織和良性病變中卻未發(fā)現(xiàn)HIF-1α蛋白過(guò)表達(dá)，表明其與前列腺癌的發(fā)病之間有著密切的關(guān)系。

為了探討HIF-1α與前列腺癌發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HIF-1α，酶切，電泳，目的片段位于2.89kb左右，載體片段位于5.3kb，和預(yù)期結(jié)果一致，序列測(cè)定所擴(kuò)增的HIF-1α片段與Genbank報(bào)道一致，然后經(jīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，中量抽提，轉(zhuǎn)染至PC-3細(xì)胞，48h后轉(zhuǎn)染效率約為45%左右，重組質(zhì)粒能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，且其表達(dá)量要高于PC-3細(xì)胞。

隨著人口老齡化、生活水平的提高，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率正逐漸上升，病死率較高〔8〕，而目前尚缺乏有效地治療方法。HIF-1α在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，可作為腫瘤生物研究的重要參照物〔9〕。成功構(gòu)建HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HIF-1 α，將為研究HIF-1α與前列腺癌發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系提供了一個(gè)有力工具，并有望作為臨床上前列腺癌的早期診斷指標(biāo)和腫瘤標(biāo)記物，間接為前列腺癌的早期診斷及治療提供較大的幫助。

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