段曉霞 鄭小林 張春玉

燒傷感染為常見(jiàn)的燒傷并發(fā)癥。國(guó)外學(xué)者研究表明燒傷感染患者由于其血漿蛋白水平的下降等生理原因，使其對(duì)藥物的處置程度也相應(yīng)發(fā)生變化，具體表現(xiàn)在藥物的腎小球?yàn)V過(guò)率增加［1］、藥物的代謝增加等，從而導(dǎo)致藥物的血藥濃度下降。為保證抗感染的效果，國(guó)外學(xué)者提出增加抗菌藥物的劑量或者縮短其給藥間隔期。頭孢吡肟為新一代的頭孢菌素類抗菌素，抗菌活性高，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶尤其是染色體介導(dǎo)的Richmond-sykesⅠ型β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，對(duì)產(chǎn)Ⅰ型β-內(nèi)酰胺酶的革蘭陰性桿菌有很強(qiáng)的抗菌活性。本藥對(duì)產(chǎn)Ⅰ型β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、沙雷菌屬的抗菌活性超過(guò)頭孢他定等第三代頭孢菌素;對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌作用與頭孢他定相似或略差;對(duì)金黃色葡萄球菌等革蘭陽(yáng)性菌的抗菌活性也比第三代頭孢菌素有所增強(qiáng)［2］。由于燒傷患者的體液平衡變化程度與燒傷的輕重程度有關(guān)，故為合理化應(yīng)用抗菌藥物，研究不同燒傷程度的抗菌藥物濃度很有必要。有關(guān)輕度燒傷感染與中度燒傷感染患者頭孢吡肟的血藥濃度的比較，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道，為優(yōu)化燒傷感染患者的抗菌藥物給藥方案，本文采用HPLC柱切換法比較了輕度與中度燒傷感染患者頭孢吡肟的血藥濃度。

1 設(shè)備與試劑

1.1 設(shè)備 Waters高效液相色譜儀(美國(guó)密理博公司)、Waters2010系統(tǒng)工作站(美國(guó)密理博公司)、Waters 996光電二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)密理博公司)、Waters510雙泵(美國(guó)密理博公司)、700柱切換閥(美國(guó)Rheodyne);HL-1型恒流泵(上海醫(yī)療器械廠);Rios超純水器(美國(guó)Millipore公司);分析柱Shim-pack C18(150 mm×4.6 mm);預(yù)柱(50 mm ×5 mm)，內(nèi)裝 μBondapak C18填料37～50μm，濕法裝柱;高速離心機(jī):上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠。

1.2 試劑 頭孢吡肟(對(duì)照品，廣州Sigma公司)、頭孢曲松(分析純，廣州Sigma公司)、乙腈(色譜純，天津四友試劑公司)、枸櫞酸鈉(分析純，廣州 Sigma公司)、二氯甲烷(分析純，廣州Sigma公司)、三氟乙酸(分析純，廣州Sigma公司)、雙蒸水(自制，電阻率18 mΩ)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品采集 樣品來(lái)源于15例輕度燒傷感染和11例中度燒傷感染男性患者，患者年齡(31±5)歲、體重(61±9)kg、體溫(38.6±0.5)℃，血清肌酐max＜104μmol/min。血清樣品均于靜脈滴注完患者2 g頭孢吡肟后的1，2，4，8和12 h采集并放置于-30℃的冰箱保存。

2.2 樣品處理 在2 ml的在血清樣品中加入1 mg/min-1頭孢曲松內(nèi)標(biāo)液50μl旋渦振蕩3 min后加入1 ml乙腈，再經(jīng)旋渦振蕩3 min后，以12000轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液加2 ml二氯甲烷后立即旋渦蕩5 min，再高速離心(12000轉(zhuǎn)/min)5 min，取上層水層進(jìn)樣25μl。

2.3 色譜條件 分析流動(dòng)相:乙腈-水(4.5∶9.5V/V)，加適量枸櫞酸鈉調(diào)pH至5.5;流速:1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):305 nm，靈敏度0.01AUFs，柱溫(30±0.1)℃;預(yù)處理流動(dòng)相:pH值2.6的磷酸溶液，流速:2.0 ml/min。

在該色譜條件下，樣品、內(nèi)標(biāo)分離良好，色譜圖譜如圖2、圖3。

2.4 柱切換分離測(cè)量流程

2.4.1 生物樣本預(yù)處理 柱切換系統(tǒng)分離預(yù)處理流程裝置見(jiàn)圖1中虛線。生物樣本注入預(yù)柱后，在預(yù)柱中進(jìn)行純化和富集，再經(jīng)預(yù)處理流動(dòng)相沖洗預(yù)柱。

圖1 柱切換系統(tǒng)分離測(cè)量流程裝置圖

2.4.2 生物樣本測(cè)量 柱切換系統(tǒng)分離預(yù)處理流程裝置見(jiàn)圖1中實(shí)線。待血漿中大部分雜質(zhì)沖洗后，高壓閥切換，使預(yù)柱和分析柱連接為串聯(lián)狀態(tài)，分析流動(dòng)相進(jìn)入預(yù)柱將保留在預(yù)柱中的氟尿苷沖洗入分析柱進(jìn)行分離測(cè)量。然后切換閥經(jīng)再次切回使分析柱和預(yù)柱的連接中斷，用預(yù)處理流動(dòng)相充分平衡預(yù)柱后，即可進(jìn)行下次進(jìn)樣。柱切換操作時(shí)間表見(jiàn)表1，血漿測(cè)量色譜見(jiàn)圖2，3。

圖2 空白血漿色譜圖

圖3 頭孢吡肟血漿色譜圖(A:頭孢吡肟，B:內(nèi)標(biāo))

表1 柱切換操作時(shí)間表

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制 將25 mg頭孢吡肟對(duì)照品溶于雙蒸水配制成2 mg/ml的原液，然后于容量瓶中稀釋為2000，1000，500，200，100，50，20，2.5 和 1 μg/ml的儲(chǔ)備液。隨后，將空白血漿加至上述儲(chǔ)備液中，配制為 200，100，50，20，10，5，2，1，0.5μg/ml的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線。將25 mg頭孢曲松對(duì)照品溶于雙蒸水配制成1 mg/ml內(nèi)標(biāo)溶液。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系 分別取標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品2 ml，按2.2項(xiàng)下處理，進(jìn)樣25μl，經(jīng)采集數(shù)據(jù)、建立頭孢吡肟光譜庫(kù)、優(yōu)化積分參數(shù)，按頭孢吡肟的濃度為橫坐標(biāo)、頭孢吡肟與頭孢曲松的峰面積比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在血漿中頭孢吡肟在0.5～200μg/ml的線性范圍內(nèi)得到線性關(guān)系良好的曲線方程:y=0.0347X+0.0059(r=0.9995)。

2.7 精密度試驗(yàn)及相對(duì)回收率試驗(yàn) 用空血漿配制頭孢吡肟0.5，10，200 μg/ml三個(gè)濃度的血樣，按“2.2”項(xiàng)下處理，進(jìn)樣，經(jīng)2010系統(tǒng)工作站，按內(nèi)標(biāo)峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法自動(dòng)求得樣品含量，計(jì)算相對(duì)回收率，結(jié)果頭孢吡肟濃度為0.5μg/ml的平均回收率(92.91±6.71)%，RSD:7.22%;10μg/ml的平均回收率(95.13±4.85)%，RSD=5.09%;200μg/ml的平均回收率(94.83±4.56)%，RSD=4.81%。

3 結(jié)果

3.1 日間差、日內(nèi)差 用空血漿配制頭孢吡肟0.5，10，200 μg/ml三個(gè)濃度的血樣，按“2.2”項(xiàng)下處理，進(jìn)樣，經(jīng)2010系統(tǒng)工作站，計(jì)算頭孢吡肟與頭孢曲松的峰面積比。日內(nèi)差(間隔1 h，n=5)與日間差(間隔24 h，n=6)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 日間差、日內(nèi)差

由表2可知日內(nèi)差、日間差的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于10%，表明實(shí)驗(yàn)方法相對(duì)穩(wěn)定。

3.2 輕度燒傷組和中度燒傷組的頭孢吡肟的血藥濃度 將輕度燒傷感染組和中度燒傷感染組的血漿樣品按2.2項(xiàng)下處理，進(jìn)樣，經(jīng)2010系統(tǒng)工作站，按內(nèi)標(biāo)峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法自動(dòng)求得樣品含量，頭孢吡肟的血藥濃度見(jiàn)表3。

表3 輕度燒傷組和中度燒傷組頭孢吡肟的血藥濃度

頭孢吡肟在輕度燒傷組和中度燒傷組的血藥濃度按成組比較，經(jīng)SPSS8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示:中度燒傷患者頭孢吡肟的代謝或消除大于輕度燒傷感染，故應(yīng)適當(dāng)縮短中度燒傷感染患者的頭孢吡肟的滴注的間隔時(shí)間或增大其用藥劑量。

4 討論

4.1 從表2結(jié)果可知，中度燒傷組的頭孢吡肟血藥濃度顯著低于輕度燒傷組(P＜0.05)，這可能與中度燒傷患者的藥物蛋白結(jié)合率有關(guān)［3］。

4.2 本文提示縮短中度燒傷感染患者的頭孢吡肟的滴注的間隔時(shí)間或增大其用藥劑量結(jié)論，主要是因?yàn)橹卸葻齻乃幯獫舛纫驘齻囊蛩卦黾恿怂幬锏拇x，故需了通過(guò)調(diào)整用藥劑量或增加用藥頻次的給藥方案提高該類患者的血藥濃度。

4.3 本實(shí)驗(yàn)在測(cè)量樣品時(shí)采用了簡(jiǎn)易的離心生物樣品處理法，該步驟有賴于柱切換液相色譜法的特點(diǎn)，回避了單純HPLC法因蛋白質(zhì)與流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑發(fā)生反應(yīng)、導(dǎo)致沉淀，堵塞色譜柱，故不能直接進(jìn)樣的缺點(diǎn)［4］。

4.4 HPLC柱切換法的原理是:樣品中的蛋白質(zhì)及其他內(nèi)源雜質(zhì)受親水性外表面的作用和孔徑大小的限制，被預(yù)處理流動(dòng)相直接洗脫出來(lái)，而樣品中的被測(cè)物在洗脫至分析柱之前被吸附在填料間隙中，得以凈化和富集，然后切換至并分析柱相連接，用分析流動(dòng)相將被測(cè)物從預(yù)柱洗脫出至分析柱，進(jìn)行分離測(cè)量。從而提高了分離和檢測(cè)效率。

［1］ Loirat P J，Rohan A.Baillet F，et al.Increased glomerular filtration rate in patients with major burns and itseffect on the pharmacokinetics of tobramycin N Engl JMed，1978，299:915-919．

［2］ Sanders，CC．Cefepime:the next generation?Clin Infect Dis，1993，17:369-379．

［3］ Martyn，J A J，D R Abernethy，D J Greenblatt．Plasma protein binding of drugs after severe burn injury.Clin.Pharmacol.Ther，1984，35:535-539．

［4］ 顧云.柱切換HPLC技術(shù)在生物樣品測(cè)定中的應(yīng)用.天津藥學(xué)，2003，15(2):80-82．