趙魯笳，邢廣瑩，王美華，劉天卿

(大連市友誼醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116001)

抑癌基因P53定位于人類染色體17P13，其等位基因的缺失和突變在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。增殖細(xì)胞核抗原/細(xì)胞周期蛋白(PCNA/cyclin)是一種在細(xì)胞G1后期和S早期廣泛表達(dá)的核蛋白，它是檢測腫瘤細(xì)胞增殖活性的常用指標(biāo)。本研究旨在探討P53及PCNA表達(dá)與腫瘤分化程度的關(guān)系，評價(jià)其在胃癌診斷及判斷生物學(xué)行為和預(yù)后中的意義。

1 材料和方法

1.1 研究材料

大連市友誼醫(yī)院1994年1月～1999年12月的進(jìn)展期胃癌65例。其中，高分化腺癌14例，中分化腺癌20例，低分化腺癌31例。另收集正常胃黏膜5例?；颊吣?52例，女13例，平均年齡60.4歲。標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)脫水浸蠟包埋，連續(xù)切片。切片厚4～6μm。試劑: P53(PAb1801),PCNA(PC10),生物素化IgG,LSAB kit均為Dako公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

切片常規(guī)脫蠟至蒸餾水后 P53行檸檬酸—微波—LSAB綜合技術(shù)法免疫組化染色；PCNA行常規(guī)LSAB法免疫組化染色，同時(shí)用已知陽性切片和TBS替代第一抗體分別作陽性及陰性對照，用Harris蘇木素液復(fù)染。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

進(jìn)展期胃癌分化程度根據(jù)傳統(tǒng)病理形態(tài)學(xué)分為高分化、中分化、低分化Ⅲ級；P53陽性細(xì)胞半定量分級參照Galand分級法[1]，整張切片或病變區(qū)無著色為0級，陽性細(xì)胞數(shù)<10%為Ⅰ級，10%～50%為Ⅱ級，>50%為Ⅲ級；PCNA陽性細(xì)胞半定量分級參照 Jain′s分級標(biāo)準(zhǔn)[2]，觀察5個(gè)具有代表性的高倍視野，按陽性細(xì)胞所占比例分為Ⅳ級，即1%～25%為Ⅰ級，26%～50%為Ⅱ級，51%～75%為Ⅲ級，76%～100%為Ⅳ級。其中，Ⅰ、Ⅱ級為弱陽性，Ⅲ、Ⅳ級為強(qiáng)陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有標(biāo)本均由兩名醫(yī)師采用雙盲法觀察切片，所得統(tǒng)計(jì)學(xué)資料行χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 正常胃黏膜P53與PCNA的表達(dá)

P53和PCNA陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞核，呈黃棕色，為顆粒型或彌漫型。正常胃黏膜P53蛋白不表達(dá)，為陰性。PCNA主要表達(dá)在胃腺中下部的細(xì)胞增殖帶，黏膜表面上皮細(xì)胞為陰性，黏膜固有層內(nèi)淋巴濾泡生發(fā)中心細(xì)胞多為陽性。

2.2 胃癌中P53蛋白與PCNA的表達(dá)

進(jìn)展期胃癌標(biāo)本65例中有35例(53.85%)有P53蛋白的表達(dá)。其中，18例P53蛋白呈過度表達(dá)，占陽性標(biāo)本的51.43%，主要表達(dá)在分化較差的腫瘤細(xì)胞增殖區(qū)，P53染色定位于細(xì)胞核，分布呈異質(zhì)性(圖1、2)。65例胃癌大部分均有明顯的PCNA表達(dá)，Ⅰ級1例(1.54%)，Ⅱ級7例(10.77%)，Ⅲ級24例(36.92%)，Ⅳ級33例(50.77%)。癌中PCNA陽性細(xì)胞成簇出現(xiàn)(圖3、4)。癌旁黏膜不典型增生PCNA呈不同程度的表達(dá),部分癌巢周圍間質(zhì)中浸潤的淋巴細(xì)胞、增殖的纖維母細(xì)胞也呈PCNA陽性表達(dá)。

2.3 P53蛋白和PCNA表達(dá)強(qiáng)度與癌組織分化程度的關(guān)系

高分化癌14例，P53陽性率為42.86%，中分化癌20例，P53陽性率為55.00%，低分化癌為31例，P53陽性率為58.06%。胃癌的分化程度與 P53陽性率之間差異無顯著性意義(P>0.05)，但是P53陽性表達(dá)率隨著癌分化程度的降低而逐漸增強(qiáng)(分別為21.43%、25.00%、32.26%)，見表1。大部分癌組織(87.69%)均有PCNA的過度表達(dá)，胃癌的分化程度與PCNA陽性率之間差異有顯著性意義(P<0.05)，隨著癌分化程度的降低PCNA陽性表達(dá)強(qiáng)度逐漸進(jìn)一步增強(qiáng)，見表2。

2.4 癌組織中 P53蛋白和PCNA表達(dá)的比較

進(jìn)展期胃癌65例中,P53和PCNA均陽性35例；P53陰性但PCNA陽性30例；PCNAⅠ～Ⅱ級8例，P53陽性3例，陰性5例；PCNA Ⅲ級24例，P53陽性14例，陰性10例；PCNA Ⅳ級33例，P53陽性20例，陰性13例。隨著胃癌惡性程度的增高，P53、PCNA的表達(dá)強(qiáng)度均隨著相應(yīng)增高，兩者呈平行關(guān)系。

3 討 論

腫瘤抑制基因 P53在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。目前的研究表明，50%以上的人類腫瘤有P53基因突變?；虍a(chǎn)物為 P53蛋白，由393個(gè)氨基酸組成，能與特異的DNA序列結(jié)合并且激活轉(zhuǎn)錄[3]。點(diǎn)突變是P53基因失活的一種方式，正常情況下，細(xì)胞內(nèi)野生型P53的表達(dá)水平很低，用一般的免疫組化方法很難檢測到，只有當(dāng) P53基因發(fā)生突變時(shí)，其蛋白產(chǎn)物才高度表達(dá)。因此，一般認(rèn)為，用免疫組化方法檢測出 P53陽性表達(dá)即表示有 P53基因突變的發(fā)生。本研究應(yīng)用檸檬酸—微波—LSAB法免疫組化技術(shù)對65例進(jìn)展期胃癌標(biāo)本進(jìn)行 P53標(biāo)記，結(jié)果顯示P53的陽性檢出率為53.85%。其中，18例有 P53蛋白的過度表達(dá)，而且P53表達(dá)強(qiáng)度隨著癌分化程度的降低而逐漸增強(qiáng)。雖然，各級癌組織 P53陽性率差異無顯著性意義(P>0.05)，但作者認(rèn)為 P53表達(dá)強(qiáng)度與癌組織分化程度有其內(nèi)在聯(lián)系。Nigro 等[4]認(rèn)為P53突變發(fā)生與腫瘤的形成過程中，其突變產(chǎn)物可能通過與野生型產(chǎn)物結(jié)合產(chǎn)生優(yōu)勢陰性效應(yīng)(dominant negative effect)從而使 P53功能失活。當(dāng)野生型等位基因更進(jìn)一步丟失時(shí)，只剩下突變的等位基因，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為排列紊亂，極性消失，增殖旺盛，速率加快，惡性程度增高，使其更具浸潤性及轉(zhuǎn)移性。本研究結(jié)果也支持這種假設(shè)。本研究在65例進(jìn)展期胃癌中發(fā)現(xiàn)有18例呈 P53的過度表達(dá)，而且大部分為中、低分化癌(>83.33%)，說明P53 基因突變不僅發(fā)生于腫瘤的形成階段而且主要發(fā)生在腫瘤細(xì)胞的發(fā)展階段即進(jìn)展期。本文結(jié)果提示，隨著腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活性的增強(qiáng),P53基因突變及產(chǎn)物 P53蛋白的積聚和表達(dá)也穩(wěn)定增加并始終貫穿于胃癌發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)演進(jìn)過程。

圖1 胃中分化管狀腺癌，P53表達(dá)陽性 LSAB法200×

圖2 胃低分化腺癌,P53表達(dá)強(qiáng)陽性 LSAB法200×

圖3 胃中分化管狀腺癌,PCNA表達(dá)陽性 LSAB法200×

圖4 胃低分化腺癌，PCNA表達(dá)強(qiáng)陽性 LSAB法400×

表1 P53蛋白表達(dá)強(qiáng)度與胃癌分化程度的關(guān)系

表2 PCNA表達(dá)強(qiáng)度與胃癌分化程度的關(guān)系

增殖細(xì)胞核抗原(PCNA/cyclin)是原位檢測腫瘤細(xì)胞增殖活性的免疫標(biāo)記物，許多研究證明PCNA合成和表達(dá)與細(xì)胞增殖狀態(tài)相關(guān)[5]。關(guān)于腫瘤生長速度與分化程度及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，目前亦有不同觀點(diǎn)。有研究者認(rèn)為，PCNA陽性細(xì)胞的多少能反映腫瘤生長速度及惡性程度，預(yù)示腫瘤轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)及患者的存活時(shí)間[6，7]；相反的觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤生長速度僅反映當(dāng)前階段腫瘤發(fā)展的狀態(tài)，僅與腫瘤細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有關(guān)，而與腫瘤組織的分化程度無必然聯(lián)系[8]。本研究中，PCNA在正常胃黏膜表達(dá)弱而規(guī)律，僅限于胃腺中下部的細(xì)胞增殖帶范圍，在胃癌中PCNA表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多。作者常觀察到灶狀的陽性細(xì)胞密集區(qū)，過度表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)>80%，PCNA表達(dá)在高、中分化癌中有一定的分布規(guī)律，而低分化癌內(nèi)PCNA陽性細(xì)胞則呈彌漫性無規(guī)律分布。分布呈異質(zhì)性，說明其增殖活躍并與正常組織相差甚遠(yuǎn)，提示癌細(xì)胞生長失控， DNA合成紊亂，同時(shí)反映腫瘤增殖細(xì)胞群中并非所有細(xì)胞均同步增殖。在癌間質(zhì)中部分浸潤的淋巴細(xì)胞及增生的纖維母細(xì)胞表現(xiàn)為PCNA陽性，說明癌細(xì)胞除了自分泌腫瘤生長因子引起自身增殖外，還可以通過旁分泌作用刺激周圍細(xì)胞增殖[9]。

本研究結(jié)果顯示，PCNA陽性分級與胃癌分化程度差異有顯著性意義(P<0.05)。癌組織分化程度越低，PCNA表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)就越多，表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng)，反映出腫瘤細(xì)胞增殖活性和分化程度的一般規(guī)律。本組中 P53的陽性表達(dá)程度與PCNA的表達(dá)呈平行關(guān)系，并有明確的量的概念，更能反映出腫瘤細(xì)胞的增殖活性與分化程度的關(guān)系，說明癌細(xì)胞增殖旺盛，增殖速率加快，P53和PCNA的過度表達(dá)增加了腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的危險(xiǎn)性。因此，采用原位檢測進(jìn)展期胃癌中P53蛋白和PCNA的表達(dá)，比傳統(tǒng)依據(jù)病理形態(tài)學(xué)和分化程度來判斷腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活性和惡性程度更為客觀、可靠，且簡便易行，對判斷預(yù)后指導(dǎo)治療有一定意義。

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