范學(xué)政,徐 璐,王 琴,趙啟祖,寧宜寶,陳 鍇

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室,北京海淀100081)

豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的一種高度接觸性傳染病,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。CSFV E2糖蛋白,既是研究新型疫苗的主要對(duì)象,也是建立CSFV血清學(xué)檢測(cè)方法的首選抗原[1-2]。目前E2基因已在多個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá),并且利用表達(dá)產(chǎn)物作為CSFV ELISA診斷抗原和亞單位疫苗進(jìn)行了探索[3-4]。

有文獻(xiàn)報(bào)道,密碼子的使用頻率會(huì)嚴(yán)重影響基因的表達(dá)量,如果對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化,則可能改善表達(dá)效果[5-6]。經(jīng)軟件分析,CSFV E2基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中使用頻率≤20%的密碼子高達(dá)85處,是否影響表達(dá)效果尚不清楚。本試驗(yàn)將豬瘟病毒E2基因進(jìn)行改造,構(gòu)建重組桿狀病毒,獲得分泌型抗原,為抗體檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pFastBac1質(zhì)粒、DH10Bac菌、sf9細(xì)胞、SNAP MidiPrep Kit為Invitrogen公司產(chǎn)品;HisTrapTMHP Nie+純化柱為 GE Healthcare產(chǎn)品;酶標(biāo)E2單抗WH303:從英國(guó)VLA引進(jìn)單抗后標(biāo)記HRP;不同豬病豬血清樣本由本實(shí)驗(yàn)室收集(經(jīng)IDEXX CSFV Ab C-ELISA試劑盒檢測(cè)驗(yàn)證);Rabbit-anti-pig HRPO為Sigma公司產(chǎn)品;其他為常規(guī)試劑。

1.2 方法

1.2.1 密碼子分析及序列改造 利用http://gcua.schoedl.de/服務(wù)器的密碼子分析軟件,分析CSFV石門株E2基因(SE2)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的使用頻率,結(jié)果發(fā)現(xiàn),SE2基因中有17種密碼子共計(jì)85處在昆蟲(chóng)細(xì)胞中使用頻率低于≤20%(見(jiàn)表1)。利用點(diǎn)突變技術(shù),將SE2基因中低頻率密碼子使用密集區(qū)域的64個(gè)密碼子進(jìn)行同義突變,改造后基因命名為MUTSE2,將改造后的序列克隆至pGEM-T-easy中進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,正確的克隆命名為pBSE2M。

1.2.2 重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建及桿粒制備 為了獲得分泌型E2蛋白,并便于純化,在E2基因N端加上蜂素信號(hào)肽(MELs),C端加上接頭及6HIS序列,順序?yàn)?啟動(dòng)子-MELs-MUTSE2-接頭-6HIS。經(jīng)測(cè)序鑒定,正確的重組轉(zhuǎn)移載體命名為 pFast-BacSE2M。將其轉(zhuǎn)化 DH10Bac,用 SNAP MidiPrepKit提取重組桿粒,經(jīng)PCR鑒定,正確的桿粒命名為bSE2M。

表1 E2基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中使用頻率≤20%的密碼子

1.2.3 轉(zhuǎn)染及病毒鑒定 用鑒定好的重組桿粒bSE2M轉(zhuǎn)染sf 9細(xì)胞,操作過(guò)程按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。獲得的病毒用PCR方法鑒定,正確的重組病毒命名為BAC/SE2M。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物分析鑒定 將鑒定好的病毒用sf 9細(xì)胞傳代培養(yǎng),取培養(yǎng)上清用ELISA方法進(jìn)行分析。操作過(guò)程為,取病毒培養(yǎng)液8 000 r/min離心5min,取上清,用 NaHCO3包被液稀釋 50×,每孔包被 100 μ L,4℃過(guò)夜;棄包被液,加 PBSM(PBS,加5%脫脂奶粉)37℃封閉 40 min;吸干,用 PBST(PBS,加 0.5%Tween-20)洗 3次,將 WH303*HRPO用 PBSTM(PBST,加 5%脫脂奶粉)稀釋1 000×,每孔加入100 μ L,37℃溫育40 min;吸干,用PBST 洗3次,每孔加入TMB工作液100 μ L,避光作用10 min,加入50 μ L終止液(2 mol/L H2SO4),測(cè)吸光值(450 nm)。

1.2.5 E2表達(dá)蛋白純化與定量 用鑒定好的毒種接種sf9細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng),接種后72 h收集培養(yǎng)液,8 000 r/min離心5 min,將上清裝入透析袋,用聚乙二醇8 000包埋濃縮。濃縮液用 HisTrapTMHP Nie+純化柱純化,純化蛋白用SDS-PAGE電泳分析,用 WH303*HRPO 進(jìn)行 Western-blot鑒定,用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.6 間接ELISA方法的初步建立 用純化的E2蛋白作為包被蛋白,檢測(cè)豬血清中的CSFV抗體。將純化的E2蛋白、豬瘟陽(yáng)性和陰性血清、Rabbit-anti-pig H RPO等進(jìn)行棋盤滴定,優(yōu)化反應(yīng)條件。根據(jù)確定的反應(yīng)條件,對(duì)13份HCLV免疫豬陽(yáng)性血清、1份PRRSV陽(yáng)性血清(PRRSVS)、1份PPV陽(yáng)性血清(PPVS)、1份 PRV陽(yáng)性血清(PRVS)、1份PCV陽(yáng)性血清(PCVS)和20份非免疫豬血清用間接ELISA檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 改造序列的測(cè)序驗(yàn)證 對(duì)CSFV E2基因經(jīng)改造后獲得的MUTSE2與設(shè)計(jì)序列一致(表2),與天然E2基因核苷酸相似性為91%,氨基酸相似性為100%。

表2 CSFV E2基因密碼子改造前后變化

2.2 重組轉(zhuǎn)移載體及重組桿粒的構(gòu)建 將Mels、MUTSE2、接頭和 6His標(biāo)簽克隆入pFastBac1,經(jīng)篩選鑒定獲得了重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacSE2M,轉(zhuǎn)化DH10Bac后進(jìn)行篩選,獲得的重組桿粒PCR擴(kuò)增條帶為3 400 bp(圖略),證明獲得了正確桿粒bSE2M。

2.3 轉(zhuǎn)染、病毒鑒定及表達(dá)分析 將重組桿粒bSE2M轉(zhuǎn)染sf 9細(xì)胞,提取重組病毒DNA經(jīng)PCR鑒定后,擴(kuò)增出了3 400 bp目的條帶,證明轉(zhuǎn)染成功。對(duì)培養(yǎng)上清用WH303*HRPO檢測(cè),結(jié)果出現(xiàn)特異的ELISA反應(yīng)(表3)。表明E2蛋白獲得了分泌性表達(dá)。

2.4 E2表達(dá)蛋白純化與定量 對(duì)E2表達(dá)蛋白經(jīng)濃縮、Nie+純化柱純化和SDS-Page電泳表明,純化產(chǎn)物分子量為40～55 kD,與理論值相符,證明獲得了純的E2蛋白。Western-blot鑒定表明表達(dá)產(chǎn)物與WH303有良好的特異性反應(yīng)(圖1)。用Bradford法測(cè)定表明E2蛋白濃度為0.21 mg/mL。

表3 細(xì)胞培養(yǎng)上清表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)

圖1 重組E2蛋白純化后 SDS-Page和 Western-blot鑒定

2.5 間接ELISA方法的初步建立 通過(guò)棋盤滴定試驗(yàn),最終確定包被E2抗原的最適包被濃度為25 ng/孔,豬瘟待檢血清的最佳稀釋倍數(shù)為100×,Rabbit-anti-pig HRPO的最佳稀釋濃度為30 000×。采用優(yōu)化濃度對(duì) 30份豬血清進(jìn)行檢測(cè),并與IDEXX CSFV Ab檢測(cè)試劑盒比較,兩種方法的符合率為 100%。該 ELISA方法不與 PRRSVS、PPVS、PRVS、PCVS存在交叉反應(yīng)。通過(guò)ELISA反應(yīng)OD值分布可以看出,陰陽(yáng)性血清OD值的區(qū)分清楚,沒(méi)有明顯的非特異性反應(yīng)(見(jiàn)圖2)。

圖2 間接ELISA檢測(cè)陰陽(yáng)性血清OD值分布

3 討論

昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(baculovirus expression system,BEVS)是一種高效的真核表達(dá)系統(tǒng),能有效進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后加工,表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性與天然蛋白十分接近,特別適合于蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究,已成功表達(dá)了多種功能蛋白。

密碼子的使用頻率會(huì)嚴(yán)重影響基因的表達(dá)量,通常,如果一個(gè)基因包含宿主細(xì)胞罕用的密碼子越多,表達(dá)就越困難[5]。如果稀有密碼子成串出現(xiàn)或出現(xiàn)在讀碼框的5′端,則會(huì)導(dǎo)致表達(dá)水平急劇下降。提高表達(dá)常用的策略就是改變目的基因的密碼子,使之更接近于宿主細(xì)胞的密碼子使用方式。如人諾如病毒衣殼蛋白等的密碼子進(jìn)行優(yōu)化后在昆蟲(chóng)細(xì)胞中成功表達(dá)。在蛋白質(zhì)研究中,密碼子優(yōu)化已越來(lái)越受到人們的重視,目前已有計(jì)算機(jī)軟件輔助設(shè)計(jì)[7],由人工設(shè)計(jì)的基因序列也成功用于功能研究[8]。CSFV E2基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中使用頻率≤20%的密碼子高達(dá)85處,且有部分區(qū)域稀有密碼子成串排列,這些都有可能降低其在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)能力。因此,本研究將低頻率密碼子密集區(qū)改造后,成功表達(dá)了E2蛋白,試驗(yàn)表明,用此蛋白建立的間接ELISA方法特異性好,與IDEXX CSFV Ab C-ELISA試劑盒有很高的符合性。

E2蛋白的羧基端由約40個(gè)氨基酸殘基組成的跨膜區(qū),疏水性極強(qiáng),對(duì)表達(dá)有一定的影響。因此,本試驗(yàn)去掉了C段的跨膜區(qū),同時(shí)在末端加上一段柔性短肽和6HIS純化標(biāo)簽,利用Nie+柱層析純化了重組E2蛋白,結(jié)果顯示,純化的E2蛋白具有良好的反應(yīng)活性。

本試驗(yàn)對(duì)CSFV E2基因進(jìn)行改造,用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得了分泌型E2蛋白,是一種有益的探索。用此蛋白建立的ELISA方法特異性好,顯示了良好的應(yīng)用前景。

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