姚華偉,范學(xué)政,徐 璐,陳 鍇,黃 偉,沙 莎,孟 萌,鄭 然,王 琴

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,重慶榮昌402460;2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室,北京海淀100081)

豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種豬的高度致死性、接觸性傳染病[1]。根據(jù)OIE制定的《陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典》2009年版,CSF被列為必須報(bào)告的疫病之一,在我國(guó)被列為“一類(lèi)動(dòng)物疫病”。豬瘟病毒的常規(guī)檢測(cè)方法存在耗時(shí)、敏感性低、特異性差等缺點(diǎn),且不能區(qū)分豬瘟野毒株和疫苗株。本實(shí)驗(yàn)室建立了豬瘟病毒熒光定量PCR方法(CSFVFQ-PCR)用于檢測(cè)所有豬瘟病毒,還建立了特異性檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗的熒光定量PCR方法(HCLV-FQ-PCR),均具有快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn);實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的歐盟豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室CSFV-RT-nPCR,也是國(guó)際上常用的檢測(cè)CSFV的方法之一。本試驗(yàn)將上述3種方法應(yīng)用于田間發(fā)病仔豬的檢測(cè),以探索發(fā)病仔豬免疫疫苗前后的帶毒情況,并在田間病例中驗(yàn)證3種檢測(cè)方法的適用性。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源 河北省某地區(qū)發(fā)病仔豬47頭,1月齡左右。首次送檢樣品經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),PRRSV、PRV、PPV、BVDV 和PCV-2病原及抗體均為陰性,有3頭豬樣本檢測(cè)顯示為豬瘟病原陽(yáng)性,豬瘟抗體陰性,其后每隔7～10 d送檢此批仔豬血樣。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 CSFV-RT-nPCR檢測(cè)方法 所用引物為歐盟豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室推薦[1-2],經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化后使用。將RT-nPCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,用于豬瘟分子流行病學(xué)[4-5]、遺傳進(jìn)化分析和豬瘟病原診斷。

1.2.2 CSFV-FQ-PCR檢測(cè)方法 為本實(shí)驗(yàn)室建立,用于檢測(cè)包括豬瘟疫苗株在內(nèi)的所有豬瘟病毒。1.2.3 HCLV-FQ-PCR檢測(cè)方法 為本實(shí)驗(yàn)室建立,用于特異性的檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗。

1.2.4 檢測(cè)方案 以首次送檢日期為第1天。第1天和第13天的血樣采用CSFV-RT-nPCR進(jìn)行檢測(cè),其中第13天有5頭死亡豬送檢樣品。第16天農(nóng)戶自行免疫豬瘟疫苗,免疫后定期送樣,直至注射疫苗后81 d。所有送檢樣品分別采用CSFV-RT-nPCR、CSFV-FQ-PCR和 HCLV-FQ-PCR 3種檢測(cè)方法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)豬瘟病毒,將CSFV-RT-nPCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序并進(jìn)行流行病學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬瘟疫苗免疫前仔豬帶毒情況 第1天及第13天送檢樣品采用CSFV-RT-nPCR方法檢測(cè),結(jié)果顯示第1天有3份樣品呈現(xiàn)豬瘟抗原陽(yáng)性,第13天有32頭豬呈現(xiàn)豬瘟抗原陽(yáng)性,第1天至第13天期間有5頭豬死亡,編號(hào)為26號(hào)、27號(hào)、29號(hào)、33號(hào)、36號(hào),死亡豬檢測(cè)結(jié)果為豬瘟病毒陽(yáng)性。

2.2 流行病學(xué)分析結(jié)果 將第1天及第13天樣品中CSFV-RT-nPCR檢測(cè)陽(yáng)性樣本進(jìn)行核苷酸序列分析,表明該批仔豬感染的CSFV屬于2.1亞群,與2.1亞群序列同源性為91.5%,與疫苗株同源性為81.0%。

2.3 豬瘟疫苗接種后抗原的檢測(cè) 采用CSFVRT-nPCR、CSFV-FQ-PCR和 HCLV-FQ-PCR三種方法分別對(duì)免疫后仔豬血樣進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表 1。其中 17號(hào)、23號(hào)、28號(hào)、30號(hào)、31號(hào)、34號(hào) 、37 號(hào) 、38 號(hào) 、39 號(hào) 、45號(hào) 、46 號(hào) 、47 號(hào)共 12 頭豬在免疫豬瘟疫苗后11 d期間陸續(xù)死亡,在表1中未列出,且12頭死亡豬3種檢測(cè)方法結(jié)果均為陽(yáng)性。

表1 仔豬免疫后帶毒情況的檢測(cè)結(jié)果

從表1可以看出,在免疫接種初期,采用3種檢測(cè)方法均可在血液中檢測(cè)到豬瘟病毒的存在。而隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng),3種方法的檢測(cè)結(jié)果開(kāi)始出現(xiàn)差異。HCLV-FQ-PCR在免疫后48 d,所有檢測(cè)結(jié)果均為陰性,由于HCLV-FQ-PCR只能特異性檢測(cè)豬瘟病毒疫苗株,說(shuō)明在免疫48 d后,已經(jīng)檢測(cè)不出血液中的疫苗毒。CSFV-RT-nPCR和CSFVFQ-PCR不能夠鑒別豬瘟野毒和疫苗毒,因此,當(dāng)感染動(dòng)物體內(nèi)尚有未被中和的野毒時(shí),二者的檢測(cè)結(jié)果仍可能為陽(yáng)性。

表2 仔豬免疫后CSFV-RT-nPCR與CSFV-FQ-PCR陽(yáng)性檢出數(shù)的比較

從表1及表2可以看出,隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng),陽(yáng)性樣本的數(shù)量逐漸減少,CSFV-RT-nPCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣本,CSFV-FQ-PCR的檢測(cè)結(jié)果也為陽(yáng)性;且隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng),CSFV-FQ-PCR陽(yáng)性樣本的檢出數(shù)高于CSFV-RT-nPCR,因此說(shuō)明,CSFVFQ-PCR的敏感性高于CSFV-RT-nPCR。

另外,從表1中可以看出部分豬在免疫豬瘟疫苗后的不同時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)了死亡現(xiàn)象。死亡豬的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),免疫豬瘟疫苗后48 d內(nèi)死亡的豬送檢樣品均可以檢測(cè)到豬瘟病毒,而免疫65 d后死亡的豬送檢樣品已經(jīng)檢測(cè)不到豬瘟病毒,通過(guò)向農(nóng)戶了解情況后得知,當(dāng)?shù)卣诒┌l(fā)藍(lán)耳病疑似疫情,因此推測(cè)這些免疫豬瘟疫苗65 d后死亡的豬可能死于高致病性藍(lán)耳病。

3 討論

3.1 關(guān)于靈敏度 本試驗(yàn)采用的CSFV-RT-nPCR方法[3]為歐盟豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室推薦的診斷方法,擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镋2基因主要區(qū)域,具有較高的靈敏度,檢測(cè)極限可達(dá)5.3×10-1pg[6],國(guó)內(nèi)外一些實(shí)驗(yàn)室也用此方法進(jìn)行豬瘟流行病學(xué)分析[4-5,7]。熒光定量PCR方法是一種靈敏的快速檢測(cè)方法,與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、污染幾率小、自動(dòng)化、高通量等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室分別設(shè)計(jì)了檢測(cè)豬瘟病毒疫苗毒及野毒的通用探針(CSFV-FQ-PCR)和專(zhuān)門(mén)檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗的鑒別探針(HCLV-FQ-PCR),CSFV-FQ-PCR的靈敏度達(dá)到5.3×10-2pg(濃度為103.84TCID50mL-1豬瘟病毒石門(mén)株感染豬血液中的病毒提取總 RNA濃度),而HCLV-FQ-PCR的靈敏度可高達(dá)到8.18×10-5pg(濃度為體外轉(zhuǎn)錄的標(biāo)準(zhǔn)品RNA濃度)。

3.2 關(guān)于豬瘟兔化弱毒疫苗的檢測(cè) 豬瘟兔化弱毒疫苗是世界公認(rèn)的效果最好的豬瘟疫苗,包括中國(guó)在內(nèi)的很多國(guó)家都采用該株疫苗預(yù)防豬瘟[8]。因此,對(duì)豬瘟疫苗毒和野毒的鑒別診斷就顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)室建立的特異性的HCLV-FQ-PCR為解決這一難題提供了有效的方法。

3.3 關(guān)于免疫后的疫苗毒在體內(nèi)的存續(xù)時(shí)間 利用HCLV-FQ-PCR,對(duì)田間感染豬瘟病毒后緊急接種豬瘟疫苗的仔豬送檢樣品進(jìn)行特異性檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn),免疫后仔豬血液中的疫苗毒存活時(shí)間可達(dá)48 d,因此提示我們,在采用分子生物學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行豬瘟診斷時(shí),應(yīng)對(duì)免疫豬瘟疫苗48 d前后的樣本進(jìn)行綜合分析,以免豬瘟疫苗株對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。3.4 關(guān)于豬瘟病毒的持續(xù)感染 通過(guò)檢測(cè)結(jié)果可以看出,有11頭豬最終存活下來(lái),但是仍然有3頭豬在88 d檢測(cè)時(shí)呈現(xiàn)CSFV陽(yáng)性,在97 d檢測(cè)時(shí)仍有1頭豬呈現(xiàn)CSFV陽(yáng)性,這說(shuō)明,豬瘟病毒的持續(xù)感染現(xiàn)象是存在的。雖然感染豬并未死亡,但是可以持續(xù)性帶毒、散毒。如果這種持續(xù)感染豬不予以清除,必然成為豬瘟的持續(xù)傳染源。因此,對(duì)于規(guī)模化豬場(chǎng)來(lái)說(shuō),定期進(jìn)行豬群檢測(cè),堅(jiān)決淘汰病原陽(yáng)性豬才是切斷豬瘟傳染源的關(guān)鍵。

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