張桂枝,靳雙星

(鄭州牧業(yè)工程高等專(zhuān)科學(xué)校畜牧系,河南鄭州450011)

近年來(lái),由于長(zhǎng)期大量濫用藥物、不合理的疫苗接種及免疫抑制病的持續(xù)存在導(dǎo)致畜禽機(jī)體免疫機(jī)能下降,抗病力降低。因此,如何激活機(jī)體的免疫系統(tǒng),提高機(jī)體的特異性和非特異性免疫,增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力是國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。目前,解決免疫抑制最有效的辦法就是使用免疫增強(qiáng)劑?，F(xiàn)已研究表明,很多藥物,如胸腺素、轉(zhuǎn)移因子、白介素、左旋咪唑等均能通過(guò)各自獨(dú)特的方式調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能,但這些物質(zhì)均有一定的副作用,而且有些藥物價(jià)格昂貴,在臨床上很難大規(guī)模推廣應(yīng)用。中草藥是中華民族的瑰寶,資源豐富,品種繁多?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明[1-4],許多中草藥對(duì)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫均有增強(qiáng)或調(diào)節(jié)作用,可提高機(jī)體的抗病力和抵抗力,作為免疫增強(qiáng)劑具有成本低、療效可靠、使用方便、便于推廣等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)利用天然中草藥,經(jīng)過(guò)篩選科學(xué)配伍出復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑,研究其對(duì)蛋仔雞免疫效果的影響,為其臨床及生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)及實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑的組成 魚(yú)腥草、金銀花、黃芪、柴胡和甘草等,按一定比例稱(chēng)取粉碎,加入適量的蒸餾水,置于鍋內(nèi)煎3次,合并濾液,然后濃縮成每毫升藥液含1 g原藥,裝瓶滅菌備用。

1.2 主要試劑 伴刀豆素球蛋白A(ConA),Sigma公司生產(chǎn);四甲基偶氮唑藍(lán)(MT T),Sigma公司生產(chǎn);RPMI 1640培養(yǎng)基,Gibco公司生產(chǎn);淋巴細(xì)胞分離液,上海恒信化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);二甲基亞砜(DMSO),分析純,天津化學(xué)試劑一廠生產(chǎn);新生小牛血清(自制)。ND-LaSota油乳劑滅活苗、新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原、新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清,均為乾元浩生物有限公司產(chǎn)品;1%紅細(xì)胞懸液(自制)。

1.3 主要儀器 DG5033A型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,南京華東電子有限公司;CO2培養(yǎng)箱,美國(guó)Revco公司生產(chǎn);倒置顯微鏡,重慶光學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡健康羅曼褐雛公雞,購(gòu)于鄭州市綠野種雞場(chǎng)孵化場(chǎng),隔離飼養(yǎng)至15日齡,選取240羽發(fā)育均勻的雛雞供試驗(yàn)用。

1.5 試驗(yàn)動(dòng)物分組 將供試的240羽15日齡健康羅曼雛公雞,隨機(jī)分為4組,每組60只。第1～3組為試驗(yàn)組,在免疫的同時(shí),飲水中加入復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑,連用1個(gè)月,第Ⅰ組添加量為1.5%,第Ⅱ組添加量為1%,第Ⅲ組添加量為0.5%,第Ⅳ組為疫苗對(duì)照組。均在15日齡時(shí)接種ND-LaSota油乳劑滅活苗0.5 mL/只。每組隔離飼養(yǎng),四組的飼料成分及飼養(yǎng)管理方式完全相同。

1.6 血清中新城疫抗體效價(jià)的測(cè)定 采用HA-HI試驗(yàn)。分別于免疫前和免疫后第7、14、21天和第28天,每組隨機(jī)抽取8只雞,經(jīng)翅靜脈采血,分離血清,測(cè)定其新城疫抗體效價(jià),抗體效價(jià)的高低用n log2表示。

1.7 免疫器官指數(shù) 免疫后第14天和第28天,每組選取10只雞,頸靜脈放血致死,迅速摘取脾臟和腔上囊,進(jìn)行稱(chēng)重并計(jì)算其免疫器官指數(shù) 。計(jì)算公式如下:免疫器官指數(shù)=免疫器官重量(g)/試驗(yàn)階段體重(kg)。

1.8 T淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定[5-6]采用M TT法。于免疫后第7、14天和第21天,每組隨機(jī)抽取6只雞,自心臟采血,肝素抗凝,測(cè)定其外周血淋巴細(xì)胞增殖。取抗凝血2 mL,加等量 Hank′s液稀釋后,用毛細(xì)吸管沿管壁緩緩加入裝有2 mL淋巴細(xì)胞分層液的離心管內(nèi),使血液重疊于分層液上,2 000 r/min離心20 min,吸取中間云霧狀的白細(xì)胞層,移入無(wú)菌離心管,適量Hank′s液洗滌2次,2 000 r/min離心10 min,棄去上清液。用RPMI 1640營(yíng)養(yǎng)液(含10%小牛血清)稀釋成1×107個(gè)/mL細(xì)胞的細(xì)胞懸液,加入終濃度為 10 μ g/mL的ConA,接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中 100 μ L/孔,再加 RPMI 1640培養(yǎng)液100 μ L/孔,然后置于 40℃5%CO2條件下培養(yǎng)44 h后取出,每孔加入M TT 10 μ L,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,2 000 r/min離心10 min棄去上清液,加入150 μ L DMSO溶液,將細(xì)胞板置于微量振蕩器上振蕩5 min,使沉淀完全溶解,用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)測(cè)定其OD值,作為T(mén)淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。

1.9 數(shù)據(jù)分析 用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 新城疫抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化 免疫前各組的抗體效價(jià)無(wú)顯著差異(P＞0.05),免疫后第 7、14、21天和第28天,試驗(yàn)組的抗體效價(jià)均高于或顯著高于疫苗對(duì)照組,且Ⅰ、Ⅱ兩組的抗體效價(jià)顯著高于Ⅲ組(P＜0.05)。但在免疫后第7天和第14天,Ⅲ組抗體效價(jià)與疫苗對(duì)照組比較,差異不顯著(P＞0.05)。免疫后的第21天和第28天,Ⅲ組抗體效價(jià)與疫苗對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)。Ⅰ、Ⅱ兩組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 疫苗免疫后各組ND-HI抗體效價(jià)變化

2.2 免疫器官指數(shù)的變化 飲用中草藥免疫增強(qiáng)劑之前各組的腔上囊、脾臟指數(shù)無(wú)差異,飲用中草藥免疫增強(qiáng)劑之后的第14天和第28天,三個(gè)試驗(yàn)組的腔上囊、脾臟指數(shù)均呈上升趨勢(shì)。且試驗(yàn)組的腔上囊、脾臟指數(shù)均高于對(duì)照組,Ⅰ、Ⅱ組顯著高于Ⅲ組(P＜0.05),但Ⅰ組與Ⅱ組相比差異不顯著(P＞0.05),Ⅲ組與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 中草藥免疫增強(qiáng)劑對(duì)免疫器官指數(shù)的影響

2.3 外周血T淋巴細(xì)胞增殖的變化 飲用中草藥免疫增強(qiáng)劑之前各組的OD值無(wú)差異,飲用中草藥免疫增強(qiáng)劑之后的第7、14天和第21天,試驗(yàn)組的OD值均高于或顯著高于對(duì)照組,且Ⅰ、Ⅱ組的OD值高于Ⅲ組但差異不顯著(P＞0.05)。其中在飲用中草藥免疫增強(qiáng)劑之后的第7天試驗(yàn)組的OD值與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05),飲用中草藥免疫增強(qiáng)劑之后的第14天和第21天,試驗(yàn)組的OD值均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 中草藥免疫增強(qiáng)劑對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響

3 討論

體液免疫是指由抗原刺激B淋巴細(xì)胞,引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞活化、增殖與分化,形成漿細(xì)胞并產(chǎn)生抗體,抗體效價(jià)的變化反映了機(jī)體的體液免疫狀態(tài)。免疫器官的發(fā)育狀態(tài)和機(jī)能強(qiáng)弱直接決定著家禽全身的免疫水平。免疫器官重量的增加可提示機(jī)體免疫機(jī)能提高,重量減輕可提示機(jī)體免疫狀況變差。T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫,T淋巴細(xì)胞的增殖是評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能的一個(gè)重要指標(biāo),采用 MT T法測(cè)得的OD值與淋巴細(xì)胞增殖率呈正比。本研究結(jié)果表明,飲用復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑之后,試驗(yàn)組的抗體效價(jià)、腔上囊及脾臟指數(shù)和淋巴細(xì)胞增殖不同程度地高于疫苗對(duì)照組。說(shuō)明復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑能夠促進(jìn)抗體的生成,增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能;能夠促進(jìn)雛雞免疫器官的發(fā)育,增加其相對(duì)重量;能夠促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞的增殖,增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。

[1]王福傳,韓一超,趙洪恩,等.復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑對(duì)雞免疫器官組織形態(tài)學(xué)影響[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2001,23(6):419-421.

[2]Chen Z S,Tan B K H,Chan S H.Activation of T lymphocy tes by polysaccharide-protein complex from Lycium barbarum L[J].International Immunopharmacology,2008,8(12):1663-1671.

[3]Liu Y B.Chemical and immune functions and clinic of preparations of Echinacea purpurea[J].World Phy taned,2001,16(2):47.

[4]Chen H L,Li D F,Chang B Y,et al.Effects of Chinese herbal polysaccharides on the immunity and growth performance of young broilers[J].Poult Sci,2003,82:364-370.

[5]楊發(fā)龍,岳華,羅薇,等.MT T法檢測(cè)雞外周血淋巴細(xì)胞增殖性反應(yīng)的最佳條件探討[J].西南民族學(xué)院學(xué)報(bào),2002,28(2):214-215.

[6]鄭鐵鎖,王貴平,胡元亮,等.復(fù)方中草藥對(duì)雛雞外周血 T淋巴細(xì)胞增殖的影響[J].畜牧與獸醫(yī),2010,42(2):110-111.