詹國平，郝麗

(中南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙，410083)

艾葉(Folium Artemisiae Argyi)為菊科植物艾(Artemisia Argyi Levl. et Vant)的干燥葉，具有散寒止痛、溫經(jīng)止血、抗菌抗病毒、平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰、消炎、抗凝血、抗過敏和護肝利膽之功效[1]。由其干燥葉片提取的揮發(fā)油即艾葉油，是其主要的藥用成分之一，已鑒定出50多種有效成分[2]。臨床上應(yīng)用艾葉油治療支氣管哮喘、過敏性皮炎、過敏性藥疹及麻風(fēng)反應(yīng)等有一定療效，其中氣霧給藥平喘有效率為67%~90%，口服平喘有效率為75%[3]。由于艾葉油易揮發(fā)，且容易受到外界影響而改變成分，在一般制劑中性質(zhì)不穩(wěn)定，目前在藥物研制上的常用新劑型是將艾葉油制成包合物，但會出現(xiàn)未包合現(xiàn)象，影響該藥物的療效。近年來，隨著化學(xué)成分及藥理研究的深入，其應(yīng)用范圍不斷擴大[4]。因此，研究艾葉油制劑新技術(shù)，提高其穩(wěn)定性有實際意義。微球制劑具有緩釋、提高穩(wěn)定性、掩味和靶向作用，作為抗腫瘤藥物靶向制劑研究已有廣泛報道[5-7]。其中明膠微球因具有生物可降解、低毒等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于藥物新劑型的研究[8-10]。目前，采用明膠將艾葉油制成微球制劑的研究較少。為此，本文作者采用乳化交聯(lián)法將提取出的艾葉揮發(fā)油制成明膠微球制劑，通過正交試驗法優(yōu)化微球制備工藝，并考察其形態(tài)學(xué)及載藥量、包封率等性質(zhì)，以獲得制備含藥微球的優(yōu)選工藝，更好地提高艾葉揮發(fā)油在制劑中的穩(wěn)定性，從而增強藥物療效。

1 實驗

1.1 試藥與儀器

試藥為：艾葉(藥用品，山東產(chǎn))；明膠(分析純，湖南湘中精細化學(xué)品廠生產(chǎn))；阿拉伯樹膠粉(分析純，湖南湘中精細化學(xué)品廠生產(chǎn))；液體石蠟(化學(xué)純，長沙南方化學(xué)試劑廠生產(chǎn))；Span-80和Tween-80復(fù)合乳化劑，為藥用級；甲醛、異丙醇、乙醇、乙醚、正己烷、硫酸、硫酸鈉、氯化鈉、香草醛等，均為分析純。

儀器為：揮發(fā)油提取器(測定器適用于測密度小于1.0 g/cm3的揮發(fā)油，江蘇省江都市紅旗玻璃廠制造)；RE-5210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠制造)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(項義市英峪予華儀器廠制造)；XS-18生物光學(xué)顯微鏡(南京江南光電儀器股份有限公司制造)；756CRT紫外分光光度計(上海精密儀器科學(xué)有限公司制造)；X-650掃描電鏡(日本日立公司制造)。

1.2 實驗方法

1.2.1 采用水蒸汽蒸餾法提取艾葉揮發(fā)油

將干燥的艾葉粉碎，稱取粉末70 g置于1 L硬質(zhì)圓底燒瓶中，加入700 g蒸餾水充分浸泡3 h。連接實驗裝置，在揮發(fā)油提取器中放入少量蒸餾水，為防止油水界面分離不清以減少損失再加入1 mL正己烷，緩緩加熱至沸，并保持微沸 4~5 h，收集油層液體，讀取艾葉油量。重復(fù)上述步驟，將收集的艾葉油混合，倒入分液漏斗，再加入適量乙醚，振搖靜置分層，取上層液。重復(fù)萃取步驟1次，合并的乙醚層用無水硫酸鈉干燥。在40~50 ℃水浴中使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加熱蒸去乙醚，得黏稠狀的綠色油狀液體即艾葉油，具有很強的芳香性氣味，干燥后稱質(zhì)量，放置在陰冷處，避光密封保存，待用。

1.2.2 制備微球的影響因素

在考察單因素的基礎(chǔ)上，固定固化時間、攪拌方式、連續(xù)相、水相體積、制備體系的pH、固化劑用量、脫水劑用量等因素，按正交試驗設(shè)計法綜合考察對微球的成形、外觀、粒徑、分布、載藥量、包封率有影響的4個主要因素，如表1所示。

表1 正交試驗因素水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 采用乳化交聯(lián)法制備明膠微球

分別稱取等量明膠和阿拉伯膠溶于適量水中，配成適宜濃度的明膠和阿拉伯膠溶液，在一定乳化溫度下加入適量艾葉揮發(fā)油，在適宜的攪拌速度下，乳化一定時間，制得揮發(fā)油初乳。將含適量 Span-80和Tween-80復(fù)合乳化劑的液體石蠟加熱到與揮發(fā)油初乳相同的溫度，再把揮發(fā)油初乳緩緩傾入到液體石蠟中，在適宜的轉(zhuǎn)速下乳化一定時間，制得復(fù)乳；然后，迅速放置在冰水浴中，在適宜轉(zhuǎn)速下攪拌，加入適量質(zhì)量分數(shù)為37%甲醛，交聯(lián)固化一定時間，控溫在5 ℃時加適量異丙醇，攪拌 5 min，進行脫水。將懸浮液靜置1夜后，離心30 min，沉淀物用異丙醇洗滌2次，抽濾，于室溫干燥，即得淡黃色粉末狀艾葉揮發(fā)油明膠微球。

1.2.4 微球的表觀形態(tài)學(xué)比較

用顯微計數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下考察制得的微球，觀察形態(tài)及粘連程度并測其粒徑，計算平均粒徑及分布。粒徑分布采用跨距表示，跨距越小，分布越窄，即粒徑越均勻。

將試驗所得微球均勻涂于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡(物鏡和目鏡放大倍數(shù)均為10)下觀測并統(tǒng)計500個微球的球徑，按下式計算跨距(sP)[11]。

式中：D10，D50和 D90分別表示在粒徑累積分布圖中相應(yīng)于累積頻率10%，50%和90%處的粒徑。對典型樣品用0.9%(質(zhì)量分數(shù))生理鹽水溶解，經(jīng)超聲分散，對制樣鍍金，使用掃描電鏡進行觀測微球形貌、粒徑及分布狀況。

1.2.5 微球的載藥量與包封率的測定

(1) 測定波長的選擇。稱取艾葉油適量，用無水乙醇稀釋至適當(dāng)濃度，以無水乙醇為空白樣，在波長200~400 nm內(nèi)掃描，采用同樣的方法處理空白明膠微球。配制相同藥物濃度的艾葉油明膠微球溶液并進行測定。

(2) 標(biāo)準曲線的建立。取干燥至恒質(zhì)量的艾葉油對照品10 mL，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻作為標(biāo)準儲備液備用。分別精密量取儲備液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL置于10 mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，靜置10 min后加入硫酸香草醛顯色劑，顯色后在最大吸收波長處測定吸光度。以吸光度對濃度進行線性回歸，得回歸方程。

(3) 微球中藥物的含量測定。采用紫外可見分光光度法，取各實驗條件下制得的微球適量，精密稱定，加質(zhì)量分數(shù)為80%乙醇5 mL，超聲20 min，經(jīng)60 ℃水浴，保溫3 h，取上清液于轉(zhuǎn)速3 000 r/min下離心10 min。各樣品精密吸取0.1 mL置于5 mL容量瓶中，硫酸香草醛顯色劑定容，置溫度為20~25 ℃處避光存放1 h，在最大吸收波長下測定吸光度，代入標(biāo)準曲線計算微球中揮發(fā)油的含量，并按下式計算其載藥量(w1)與包封率(w2)。

式中：mV為微球中所含揮發(fā)油質(zhì)量；mA為微球總質(zhì)量；mW為微球中包封的含藥量；mS為微球中包封和未包封的總藥量。

對微球工藝條件優(yōu)劣進行考察，采用載藥量(w1)、包封率(w2)、粒徑分布(sP)等指標(biāo)進行評價。每項采用10分制，載藥量以10%作參照，越接近它，給分越高；包封率以50%作參照，越接近它，給分越高；粒徑分布越窄，分值越大。根據(jù)各指標(biāo)對實驗結(jié)果的影響程度，確定其影響系數(shù)分別為0.5，0.3和0.2，并按下式計算綜合評分Z。

式中：w1i為各實驗載藥量；w2i為各實驗包封率；sPi為各實驗粒徑跨度；w1max為最大載藥量；w2max為最大包封率；sPmax為最大粒徑跨度。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗優(yōu)選工藝結(jié)果

以明膠和阿拉伯膠溶液為水相，使水相在油相石蠟中分散、乳化成小液滴，制備成油包水型乳液。調(diào)節(jié) pH使明膠微球進行復(fù)凝聚，降溫冷卻后，加入固化劑甲醛使其交聯(lián)，再加入脫水劑異丙醇把微球的水分脫去，通過離心、抽濾等方法將其分離出來。實驗過程中發(fā)生的主要反應(yīng)為交聯(lián)反應(yīng)。甲醛的作用機制是先與氨基反應(yīng)形成羥甲氨基，再與另一個氨基(分子內(nèi)的或另一個分子的)反應(yīng)形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，使微球表面形成較高密度的交聯(lián)鍵而固化[12-13]。阿拉伯膠為水溶性膠體，而且具有高度的可溶解性[14-15]，在微球制備過程中可以使微膠囊化效率增加。正交試驗結(jié)果及分析結(jié)果如表2所示。

由方差分析可知：C(明膠和阿拉伯膠質(zhì)量與藥油質(zhì)量之比)對微球工藝顯著性影響最大，其次為A(明膠和阿拉伯膠質(zhì)量分數(shù))、B(乳化溫度)，而D(攪拌速度)影響不顯著。乳化時間對微球的影響不是很大，只是當(dāng)乳化時間不夠時，才會造成乳液分散不均勻，影響微球的粒徑分布。

綜合結(jié)果表明：4種因素中，因素A的K3最大，所以選擇明膠和阿拉伯膠質(zhì)量分數(shù)為30%；因素B的K1最大，所以，選擇40 ℃為乳化溫度；因素C的K1最大，所以選擇質(zhì)量比為3:1。若明膠和阿拉伯膠溶液與藥油質(zhì)量比太小，則揮發(fā)油轉(zhuǎn)型不完全，若該質(zhì)量比太大，則導(dǎo)致微球粘連。這可能是高濃度的明膠和阿拉伯膠溶液黏度大，在乳化過程中，不易被乳化形成小乳滴所致。因素D的K1最大，所以，選擇攪拌速度為300 r/min。綜上所述，艾葉揮發(fā)油明膠微球的最佳工藝條件為A3B1C1D1，即：明膠和阿拉伯膠溶液質(zhì)量分數(shù)為30%，乳化溫度為40 ℃，明膠和阿拉伯膠質(zhì)量與藥油質(zhì)量之比為 3:1，攪拌速度為低速 300 r/min。微球的平均粒徑與分布在很大程度上受乳化過程中攪拌速度的影響，在乳化過程中攪拌速度提高會導(dǎo)致微球粒徑減小和粒徑分布變窄，但是，當(dāng)轉(zhuǎn)速太高時會導(dǎo)致微球粘連現(xiàn)象加劇。艾葉揮發(fā)油明膠微球的球徑與初乳乳滴的粒徑有密切關(guān)系，故制備初乳時，宜采用高速乳化。制備復(fù)乳時，為防止初乳破裂，應(yīng)低速乳化。在交聯(lián)過程中，攪拌速度對微球的最后粒徑幾乎沒有影響，其原因可能是：在乳化階段增加攪拌速度，借助攪拌提供的能量有利于油相被分散成細小的乳滴，使微球的粒徑變小；但轉(zhuǎn)速太高時也會加劇已分散微球的碰撞凝聚，出現(xiàn)粘連；而在交聯(lián)過程中，由于甲醛的加入，乳液中含有明膠的小液滴能立即交聯(lián)固化，阻止它們的連接和聚合，從而與攪拌速度聯(lián)系較小。

表2 正交試驗結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

2.2 微球的載藥特性

艾葉油在波長272 nm處有最大紫外吸收，而在此波長下明膠與阿拉伯膠混合液無吸收，對測定結(jié)果無干擾。艾葉油明膠微球溶液，吸收光譜與純藥物吸收光譜一致，吸收強度相同，說明微球化后艾葉油的紫外吸收光譜無變化，故選擇272 nm作為紫外檢測波長。以艾葉油濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線，經(jīng)回歸處理，得到線性回歸方程：

Y=51.185 89X+ 0.0482 79 (相關(guān)系數(shù)為0.999 9)

按照正交試驗法篩選得到的最佳工藝，制備3批艾葉油明膠微球樣品，其微球的平均收率為73.92%。采用紫外可見分光光度法測定微球中所含艾葉油的含量，并計算載藥量和包封率，方法如前所述，結(jié)果見表 3，得其平均載藥量為 8.52%，平均包封率為29.35%。該結(jié)果優(yōu)于正交試驗條件的實驗結(jié)果，表明采用此工藝條件制備明膠微球是可行的。

明膠和阿拉伯膠溶液的濃度與載藥量密切相關(guān)，濃度越大，載藥量越大，但相應(yīng)的包封率會下降。

表3 樣品的載藥量與包封率Table 3 Drug-loading rate and entrapment rate of samples

2.3 微球的形態(tài)學(xué)性質(zhì)

2.3.1 微球的外觀形態(tài)觀察

按最佳工藝制備，制得的微球為淡黃色粉末，經(jīng)光學(xué)顯微鏡(物鏡和目鏡放大倍數(shù)均為10)觀察，微球外觀圓整，粒徑較均勻，分散性良好，較少粘連。空白明膠微球與最佳制備工藝下艾葉油明膠微球樣品的生物顯微鏡照片如圖1~2所示。

圖1 空白明膠微球顯微照片F(xiàn)ig.1 Microphotograph of blank gelatin microspheres

圖2 艾葉油明膠微球最佳工藝顯微照片F(xiàn)ig.2 Microphotograph of optimal technique gelatin microspheres of volatile oil of Folium Artemisiae Argyi

2.3.2 微球粒徑的測定

將試驗所得微球均勻涂于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下用測微尺目測微球直徑，以每隔 5 μm球徑為 1組，分為7組，按下式計算平均粒徑(Dav)：

式中：n為微球數(shù)量；d為每組微球直徑的中間值。計算微球的平均粒徑為22.31 μm，粒徑范圍為10~30 μm的微球質(zhì)量分數(shù)為83.91%。

2.3.3 明膠微球的掃描電鏡(SEM)觀察與分析

對最佳工藝條件下所得微球的分散度、交聯(lián)程度、具體粒徑、球形度以及表面形態(tài)進行較準確分析，進行300倍和1000倍掃描電鏡觀察，其SEM圖像如圖3所示。

從圖3可以看出：明膠微球?qū)嶋H上是一個多孔的球體，這些孔洞的存在有利于微球的吸附載藥，表面上存在的白色物質(zhì)為艾葉揮發(fā)油。微球形態(tài)及粘連程度并測其直徑，得出平均粒徑約為23.25 μm，比采用光學(xué)顯微鏡測定的結(jié)果偏大。這可能是微球在溶液中發(fā)生溶脹所致。

圖3 不同掃描倍數(shù)下艾葉油明膠微球的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.3 SEM micrographs of gelatin microspheres of volatile oil of Folium Artemisiae Argyi

3 結(jié)論

(1) 采用乳化交聯(lián)法，根據(jù)正交優(yōu)化設(shè)計，制得微球外觀圓整，粒徑較均勻，分散性良好，較少粘連，平均粒徑約為23.25 μm。篩選得到的最佳工藝如下：明膠和阿拉伯膠溶液的適宜質(zhì)量分數(shù)為30%，適宜乳化溫度為40 ℃，明膠和阿拉伯膠與藥油質(zhì)量比為3:1，攪拌速度為300 r/min。

(2) 乳化劑的種類和濃度對微球粒徑有影響，濃度越高，制得微球的粒徑越??；反之，制得的微球粒徑越大。運用Span-80與Tween-80復(fù)合乳化劑比單一乳化劑效果好，取樣容易，乳化劑之間產(chǎn)生了配伍協(xié)同作用。且因阿拉伯膠具有很好的水溶性和乳化性，配以明膠一起使用，在微球制備過程中可以使微膠囊化效率增加。

(3) 通過紫外分光光度法測定微球中的藥物含量，計算得其平均載藥量為 8.52%，平均包封率為29.35%。表明采用此工藝條件制備明膠微球切實可行，工藝簡單，產(chǎn)品穩(wěn)定。

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