左北瑤 ，錢宏光 ，王子玉 ，汪立芹 ，郭志勤

（1.新疆巴州畜牧工作站，庫(kù)爾勒 841000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)中心，江蘇 210095；4.新疆畜牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)部家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室）

德國(guó)肉用美利奴羊（德美羊）是肉毛兼用品種，繁殖力高、被毛品質(zhì)好，尤其是肉用性能突出，引入我國(guó)后在土種羊改良和細(xì)毛羊培育中起了巨大作用，如與中國(guó)美利奴羊（新疆型）雜交后，F(xiàn)1代在各階段平均體重比中國(guó)美利奴羊（新疆型）提高0.07～2.10 kg，體尺指標(biāo)也有明顯改善［1］。為進(jìn)一步提高德美羊的良種覆蓋率，亟需采用胚胎移植技術(shù)進(jìn)行快速擴(kuò)繁。但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于德美羊超數(shù)排卵、胚胎移植的研究較少。為充分利用不同年齡段的良種德國(guó)肉用美利奴羊，本試驗(yàn)優(yōu)化了超排方案，研究了供體年齡與超排和胚胎移植效果的關(guān)系，為進(jìn)一步提高綿羊胚胎移植效率提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供、受體 供體為純種德國(guó)肉用美利奴羊，按年齡分為青年（18月齡，配種未受胎）、老齡（60～72月齡，經(jīng)產(chǎn)）以及幼齡母羊（7月齡，性成熟前）3組。受體為新疆地方品種巴音布魯克成年母羊。

1.2 超排及同期發(fā)情藥品 促卵泡素（FSH）：寧波三生藥業(yè)生產(chǎn)；促黃體素（LH）、孕馬血清促性腺激素（PMSG）、前列腺素（PG）、促黃體素：寧波生產(chǎn)；Y 形陰道栓（CIDR）、孕酮陰道海綿栓：澳大利亞生產(chǎn)。

1.3 供體的預(yù)處理

1.3.1 青年組及老齡組的預(yù)處理 間隔11 d 2次肌注PG（0.1 mg/只），挑選出發(fā)情時(shí)間在 36～48 h之間的母羊作為供體。供體母羊按方案設(shè)計(jì)分組，其中青年羊9只，老齡羊4只，置入CIDR，在放栓的第13天取出陰道栓，肌注PG 0.1 mg，試情，記錄發(fā)情日期。隨機(jī)挑選青年、老齡母羊各2只，在超排處理前情期的第2天分2次間隔12 h肌注FSH 20 u。

1.3.2 幼齡母羊的預(yù)處理 每只幼齡母羊肌注500 u的PMSG，挑選3 d內(nèi)發(fā)情的2只作為供體，記錄發(fā)情日期。

1.4 供體的超排 本試驗(yàn)主要是從漏配或配種未受胎的德美母羊群中選取供體，其繁殖性能參差不齊。為提高供體超排效果，采取了人工誘導(dǎo)發(fā)情與自然發(fā)情相結(jié)合的處理程序，即在誘導(dǎo)發(fā)情之后增加一個(gè)自然發(fā)情周期，在自然發(fā)情周期結(jié)束前超排。對(duì)已同期處理的供體，根據(jù)年齡和體重調(diào)整FSH劑量，總量為120～200 u，在情期的第13～15天連續(xù)3 d減量肌注FSH，并在第3天上午，注第5針FSH的同時(shí)注PG 0.1mg。第16天早上開(kāi)始試情，對(duì)發(fā)情羊肌注促黃體素100 u，人工授精3～4次（每次間隔12 h）。

1.5 供體的采胚 在供體首次發(fā)情配種后第6.5天進(jìn)行子宮角采胚［2］。在顯微鏡下判斷是否可用及胚胎發(fā)育階段，分為 16細(xì)胞（16C）、致密桑椹胚（compaction morula，CM）、囊胚（blastocyst，B）。

1.6 受體同期發(fā)情 在供體撤栓后的第4天將孕酮海綿栓置入同組受體陰道中，在放栓后的第10天肌注400u PMSG，第12天撤栓，肌注PG 0.1mg，翌日試情，標(biāo)記發(fā)情羊。

1.7 胚胎移植 采用子宮角移植，選擇與供體發(fā)情同步（同天或早0.5 d以內(nèi)）的作為同組供體胚胎的移植受體。以術(shù)后2情期未返情判定為妊娠。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 供體年齡對(duì)德美羊超排效果的影響 由表1可見(jiàn)，15只供體共采集胚胎162枚，只均采胚數(shù)10.8枚，其中可用胚胎總數(shù)151枚，只均可用胚數(shù)為10.1枚，胚胎可用率93.2%。青年、老齡、幼齡母羊超排后只均可用胚數(shù)分別為10.9、10.3和6.0枚，青年、老齡組可用胚數(shù)顯著高于幼齡組（P＜0.05），可用胚率差異不顯著（P＞0.05）。單只最多采出可用胚16枚。

表1 供體年齡對(duì)德美羊超排效果的影響

2.2 供體年齡與德美羊胚胎發(fā)育速度的關(guān)系 供體首次發(fā)情配種后第6.5天時(shí)手術(shù)回收胚胎，顯微鏡下判斷各年齡組羊胚胎的發(fā)育階段，結(jié)果（表2）表明，回收的胚胎中囊胚所占比例幼齡組（24.9%）、青年組（23.5%）顯著高于老齡組（0）（P＜0.05），老齡組胚胎主要為致密桑葚胚（95.1%），說(shuō)明幼齡、青年組供體的胚胎發(fā)育速度顯著快于老齡供體。

表2 供體年齡與德美羊胚胎發(fā)育速度的關(guān)系

2.3 供體超排前預(yù)注小劑量FSH對(duì)德美羊超排后卵巢黃體數(shù)量的影響 在超排處理前情期的第2天，預(yù)注小劑量FSH（20 u）的青年組和老齡組供體，其黃體數(shù)均顯著多于對(duì)照組（P＜0.05），老齡供體由10個(gè)提高到20個(gè)，青年組由12.3個(gè)提高到16.5個(gè)（表3），說(shuō)明超排前預(yù)注小劑量FSH能顯著促進(jìn)超排后卵泡成熟與排卵。

表3 供體超排前預(yù)注小劑量FSH對(duì)德美羊超排后卵巢黃體數(shù)量的影響

2.4 供體年齡對(duì)德美羊胚胎移植受胎率的影響 同期處理受體168只，其中162只受體發(fā)情，受體同期成功率96.4%，共移植受體122只，妊娠79只，妊娠率64.8%。青年組、老齡組、幼齡組的妊娠率分別為71.6%、58.3%和41.7%。青年組和老齡組供體母羊胚胎移植后的妊娠率顯著高于幼齡組（表4）。

表4 供體年齡對(duì)德美羊胚胎移植受胎率的影響

3 討論

3.1 供體年齡與德美羊超排效果及移植受胎率的關(guān)系 供體年齡對(duì)超排處理后德美羊回收胚胎數(shù)量和胚胎質(zhì)量具有較大影響。青年、老齡組德美母羊超排后只均可用胚數(shù)分別為10.9枚和10.3枚，顯著高于幼齡母羊的6.0枚（P＜0.05），表明經(jīng)產(chǎn)成年母羊和性成熟青年羊的超排效果比幼齡母羊好。這與趙曉娥［3］、張鎖林［4］等在波爾山羊、張果平［5］等在杜泊綿羊上的結(jié)果類似。青年、老齡組母羊的胚胎經(jīng)移植后受胎率分別為71.6%、58.3%，顯著高于幼齡組的41.7%，說(shuō)明經(jīng)產(chǎn)成年母羊和性成熟青年羊所獲得胚胎質(zhì)量相對(duì)較高，原因可能是性成熟前幼齡母羊卵巢機(jī)能及生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)能尚不完善，影響了卵母細(xì)胞的質(zhì)量和胚胎發(fā)育過(guò)程。因卵母細(xì)胞的發(fā)育能力與供體日齡密切相關(guān)［6］，幼齡德美羊卵巢中卵母細(xì)胞經(jīng)超排后雖能排卵和受精，但其中的部分卵母細(xì)胞可能胞質(zhì)成熟不完全。因此選擇供體應(yīng)以經(jīng)產(chǎn)成年羊?yàn)槭走x，年齡不超過(guò)5歲，其次為青年羊；為提早利用優(yōu)良種畜，縮短世代間隔，也可在7月齡以上的羔羊中初選發(fā)育快、體成熟早的個(gè)體，在超排程序上先注PMSG催情處理，然后以發(fā)情羊?yàn)楣w超排。

3.2 供體年齡與德美羊胚胎發(fā)育速度的關(guān)系 6.5 d時(shí)回收的胚胎中囊胚所占比例幼齡組（24.9%）、青年組（23.5%）顯著高于老齡組（P＜0.05），說(shuō)明老齡供體的胚胎發(fā)育速度相對(duì)較慢。為取得更高比例的適齡胚胎，回收胚胎時(shí)除要十分重視計(jì)算供體的發(fā)情配種時(shí)段與受體發(fā)情時(shí)段的準(zhǔn)確匹配之外，對(duì)供體年齡因素亦不應(yīng)忽略，如供體整體年齡偏老，采胚手術(shù)應(yīng)適當(dāng)后延，反之可適當(dāng)提前；如供體年齡老幼混雜，幼齡羊采胚應(yīng)在前，老齡羊應(yīng)在后。

3.3 德美羊超排程序的優(yōu)化 供體的超排效果取決于兩個(gè)方面：一是供體本身具備正常的繁殖機(jī)能，二是外源激素的剌激與內(nèi)源的周期協(xié)同作用。根據(jù)這個(gè)原理利用PG處理挑選出繁殖機(jī)能正常的母羊，再利用孕酮海綿栓調(diào)節(jié)發(fā)情周期，然后在其自然情期用外源激素進(jìn)行超排，能夠保證較好的超排效果。FSH在卵泡腔的形成過(guò)程中起重要作用，能剌激顆粒細(xì)胞的有絲分裂和卵泡液的形成，還可以通過(guò)增加LH感受器的數(shù)目而誘發(fā)顆粒細(xì)胞對(duì)LH的敏感性。母畜在排卵前的20～30 h出現(xiàn)第2次FSH高峰，其目的是啟動(dòng)另一批卵泡形成卵泡腔，為下一個(gè)情期排卵做準(zhǔn)備。排卵率高的羊此峰值明顯高于排卵率低的羊，而且分泌的FSH量與17 d后卵巢上有腔卵泡數(shù)量呈正比［7］。本試驗(yàn)表明在超排處理前情期的第2天，用小劑量的FSH肌注做預(yù)處理，提高血清中FSH水平可顯著提高超排效果，使更多的卵母細(xì)胞成熟和排卵，與Armstrong在牛上的結(jié)果類似［8］。

4 結(jié)論

綜上所述，本試驗(yàn)證明供體年齡顯著影響德美羊的超排效果及胚胎質(zhì)量，以青壯年羊（2～5歲）的效果最好，但為了充分利用數(shù)量有限的良種個(gè)體，也可對(duì)老齡和性成熟前母羊進(jìn)行超排。通過(guò)人工誘導(dǎo)發(fā)情與自然發(fā)情相結(jié)合的處理程序和低劑量FSH預(yù)處理改善了德美羊的超排效果，為今后進(jìn)一步提高綿羊胚胎移植的效率提供了依據(jù)。

［1］劉武軍，楊菊清，喻世剛，等.德美與中美（新疆型）雜交后代體尺體重變化［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2008，35（7）：131-134.

［2］郭志勤.家畜胚胎工程［M］.北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1998.

［3］趙曉娥，武浩，權(quán)富生，等.波爾山羊胚胎移植試驗(yàn)研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002，11（4）：92-94.

［4］張鎖林，王述宇.波爾山羊超數(shù)排卵方案的研究［J］.中國(guó)草食動(dòng)物，2001，21（4）：10-14.

［5］張果平，王金文，王德芹，等.影響杜泊綿羊超數(shù)排卵效果的因素分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25（2）：324-328.

［6］Armstrong D T.Effects of maternal age on oocyte developmental competence［J］.Theriogenology，2001，55（6）：1303-1322.

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