張茂華，劉曉妮，李志軍

（1.山西省畜牧遺傳育種中心，太原 030027；2.山西省生態(tài)畜牧產(chǎn)業(yè)管理站，太原 030001；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科院）

家畜精液保存技術(shù)是一項(xiàng)先進(jìn)的動(dòng)物繁殖技術(shù)，它是隨著人工授精技術(shù)的廣泛運(yùn)用而產(chǎn)生的，是人工授精技術(shù)的重大革新。在溫度變化過程中，精清對(duì)精子的保護(hù)能力是有限的，為了延長(zhǎng)精子在體外的存活時(shí)間和受精力，便于保存和運(yùn)輸，常向精液中加入適宜精子存活的稀釋液。稀釋液是精子的保護(hù)劑，其成分和含量必須符合精子的生物學(xué)特性和低溫保護(hù)性能。本試驗(yàn)選擇一種國(guó)外稀釋液和我國(guó)普遍應(yīng)用的稀釋液進(jìn)行比較，以評(píng)定不同稀釋液對(duì)牛冷凍精液品質(zhì)的影響，對(duì)牛冷凍精液新型稀釋液的開發(fā)和牛冷凍精液品質(zhì)的提高具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 進(jìn)口稀釋液：某國(guó)進(jìn)口稀釋液，200mL/瓶。自配稀釋液：果糖，三羥甲基氨基甲烷（Tris），甘油，檸檬酸，卵黃（新鮮雞蛋中取），青霉素，鏈霉素，雙蒸餾水。

1.1.2 儀器 法國(guó)卡蘇公司進(jìn)口的細(xì)管精液設(shè)備，冰箱，電子天平，電熱恒溫干燥箱，電熱恒溫水浴鍋，普通顯微鏡，移液器，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)器，離心機(jī)，液氮罐，牛用采精器械，電子恒溫板。

1.1.3 稀釋液的配置 稀釋液Ⅰ（國(guó)產(chǎn)稀釋液）：第1液，雙蒸水73mL、三羥甲基氨基甲烷2.42 g、檸檬酸1.34 g、果糖1 g、甘油7mL，混合熱溶滅菌30 min；第2液，取第1液80mL，加入新鮮卵黃20mL、青霉素16萬u、鏈霉素10萬u。

稀釋液Ⅱ（進(jìn)口稀釋液）：取進(jìn)口稀釋液20mL，加入雙蒸水80mL，混合均勻。

1.2 方法

1.2.1 采精與精子質(zhì)量評(píng)定 2010年在山西省家畜凍精中心選取10頭體格健康、性欲旺盛、采過精液的種公牛，其中包括5頭荷斯坦公牛和5頭夏洛萊公牛。實(shí)驗(yàn)室鏡檢鮮精活率、活率、密度和畸形率；鮮精質(zhì)量要求：精子濃度大于6億/mL，活率大于0.7，畸形率小于10%。合格精液方可用于冷凍。

1.2.2 精液稀釋 將每份合格精液立即將其平均分成2等份，放在2個(gè)大試管中，分別用2種稀釋液按相同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋。

用稀釋液Ⅰ和Ⅱ稀釋的精液，放在4℃低溫柜中平衡4 h。

1.2.3 精液的分裝和冷凍 平衡后的稀釋精液，用分裝機(jī)吸入有標(biāo)識(shí)（如牛號(hào)等）的塑料細(xì)管內(nèi)并封口。把參試牛的細(xì)管均勻擺放到同一金屬架上，以保證冷凍環(huán)境的一致，每架擺放175支細(xì)管。擺有細(xì)管的金屬架放入冷凍箱中冷凍，當(dāng)細(xì)管的溫度降到-140℃時(shí)，把細(xì)管浸入液氮中待用。

1.2.4 精液的解凍 每頭牛每種稀釋液的細(xì)管精液取3支，浸泡到39℃的溫水中解凍，待精液完全融化時(shí)馬上從溫水中拿出，擦干水跡待檢。

1.2.5 精子質(zhì)量檢測(cè)

1）精子活率檢查：3支細(xì)管分別直接置于39℃水浴中解凍，取解凍3支混合后精液約50 μL置于載玻片上加蓋玻片，立即在載物臺(tái)保持38℃的情況下用200～400倍顯微鏡觀察活率，也可通過電視顯微裝置在熒光屏上觀察活率。每樣片觀察3個(gè)視野，并應(yīng)觀察不同液層內(nèi)的精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，進(jìn)行全面評(píng)定。

3）畸形率（包括頂體完整率）的測(cè)定：姬姆薩染色法：①抹片：取1～2滴精液滴于載片一端，用另一邊緣光滑的玻片與有樣品的玻片呈35度，將樣品均勻涂抹于載玻片上，自然風(fēng)干（約15 min）。②固定：在風(fēng)干抹片上滴1～2mL中性福爾馬林固定液，固定15 min后用清水緩緩沖去固定液，吹干或自然干燥。③染色：將干燥的固定后的抹片反扣在帶有平槽的有機(jī)玻璃板面上，把姬姆薩染色液滴于槽和抹片之間，讓其充滿平槽并使抹片接觸染液，染色1.5 h后用清水緩緩沖去染液，晾干待檢。④鏡檢：將制備好的抹片在400倍顯微鏡下觀察精子畸形率；而頂體完整率是在抹片上滴一滴香柏油，置于400倍顯微鏡下觀察。⑤每樣品制作兩個(gè)抹片，每抹片觀察300個(gè)精子以上（分左右兩個(gè)區(qū)），取兩片的平均值，兩片的變異系數(shù)不得超過20.0%。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種稀釋液對(duì)荷斯坦奶牛和夏洛萊肉牛精液解凍后活率的影響 給定顯著性水平α=0.05，由t值表查得t0.05（8）=2.306。由表 1 可知，對(duì)兩種稀釋液稀釋 HS（荷斯坦牛）牛精液解凍后的成活率進(jìn)行t檢驗(yàn)，|t|=0.307＜2.306，表明所采用的兩種稀釋液處理HS牛精液解凍后的成活率差異不顯著（P＞0.05）；對(duì)兩種稀釋液稀釋XL（夏洛萊肉牛）精液解凍后的成活率進(jìn)行t檢驗(yàn)，|t|=0.069＜2.306，表明所采用的兩種稀釋液處理XL牛精液解凍后的成活率差異不顯著（P＞0.05）。

表1 兩種稀釋液對(duì)荷斯坦奶牛和夏洛萊肉牛精液解凍后活率的影響%

2.2 兩種稀釋液對(duì)荷斯坦奶牛和夏洛萊肉牛精液解凍后畸形率的影響 給定顯著性水平α=0.05，由t值表查得 t0.05（8）=2.306。由表 2可知，對(duì)兩種稀釋液稀釋 HS牛精液解凍后畸形率進(jìn)行t檢驗(yàn)，|t|=0.223＜2.306，表明所采用的兩種稀釋液處理HS牛精液解凍后畸形率差異不顯著（P＞0.05）；對(duì)兩種稀釋液稀釋XL牛精液解凍后畸形率進(jìn)行t檢驗(yàn)，|t|=0.039＜2.306，表明所采用的兩種稀釋液處理XL牛精液解凍畸形率差異不顯著（P＞0.05）。

表2 兩種稀釋液對(duì)荷斯坦奶牛和夏洛萊肉牛精液解凍后畸形率的影響%

2.3 兩種稀釋液對(duì)荷斯坦奶牛和夏洛萊肉牛精液解凍后頂體完整率的影響 給定顯著性水平α=0.05，由t值表查得t0.05（8）=2.306。由表3可知，對(duì)兩種稀釋液稀釋HS牛精液解凍后頂體完整率進(jìn)行t檢驗(yàn)，|t|=2.368＞2.306，表明所采用的兩種稀釋液處理HS牛精液解凍后頂體完整率差異顯著；對(duì)兩種稀釋液稀釋XL牛精液解凍后頂體完整率進(jìn)行t檢驗(yàn)，|t|=3.150＞2.306，表明所采用的兩種稀釋液處理XL牛精液解凍后頂體完整率差異顯著（P＜0.05）。

表3 兩種稀釋液對(duì)荷斯坦奶牛和夏洛萊肉牛精液解凍后頂體完整率的影響%

3 討論與分析

卵黃因含有卵磷脂，能穩(wěn)定精子細(xì)胞膜，防止頂體破裂；其融點(diǎn)低，在低溫下不易被凍結(jié)，加入精液后可透入精子內(nèi)代替縮醛磷脂而被利用，故可保護(hù)精子防止冷休克的發(fā)生。Moussa等［1］認(rèn)為，卵黃中的低密度脂蛋白（LDL）在精子冷凍過程中可抵御低溫打擊，提高精子活率、頂體完整率和質(zhì)膜完整性。目前，對(duì)卵黃的研究還在繼續(xù)，Andrabi等［2］試驗(yàn)證實(shí)，添加鴨卵黃冷凍水牛精液效果明顯好于其它禽類卵黃。

但是，卵黃應(yīng)用于稀釋液中存在一定的弊端：卵黃內(nèi)可能存在著病原菌，會(huì)在稀釋液的攜帶下傳播，影響動(dòng)物冷凍精液在國(guó)際和國(guó)內(nèi)的種質(zhì)交流；此外，在有氧條件下，卵黃中的某些氨基酸在酶作用下，可能產(chǎn)生對(duì)精子有害的過氧化氫?？紤]到這些不利因素，國(guó)外一些國(guó)家在稀釋液中已經(jīng)不使用卵黃、牛奶這類動(dòng)物源性添加物，正流行著用大豆卵磷脂取代卵黃，以避免卵黃中病原體的傳播。Leeuw等［3］和Thun等［4］分別用大豆提取物的稀釋液處理牛精液，效果都不理想，不返情率顯著低于對(duì)照組。Moussaa等［1］、胡建宏等［5］均報(bào)道利用 LDL代替卵黃在牛和豬上冷凍精液效果比商業(yè)用的稀釋液好。

從試驗(yàn)結(jié)果來看，稀釋液Ⅰ和稀釋液Ⅱ?qū)δ膛：腿馀＠鋬鼍旱幕盥屎突温视绊懖淮?，但是使用稀釋液Ⅰ稀釋的奶牛和肉牛精液的頂體完整率顯著高于使用稀釋液Ⅱ稀釋的奶牛和肉牛精液的頂體完整率。

進(jìn)口稀釋液無卵黃不含動(dòng)物源成分，稀釋后的精液細(xì)菌數(shù)少，降低了精液的污染風(fēng)險(xiǎn)，使用簡(jiǎn)單，用蒸餾水稀釋即可使用。但購(gòu)買成本昂貴。保存周期長(zhǎng)。極易因保存條件變化而影響使用效果。而國(guó)產(chǎn)稀釋液取材簡(jiǎn)單，可以隨配隨用，而且成本相比較低。雖操作略繁瑣一些，但頂體完整率略占優(yōu)勢(shì)，有好的受胎率，也是一種很好的稀釋液配方。對(duì)未來開發(fā)新的稀釋液配方有一定的指導(dǎo)意義。

［1］MoussaM，MartinetV，Trimeche，etal.Low densitylipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method：cryoprotective effect on frozen-thawed bullsemen［J］.Theriogenology，2002，57（6）：1695-1706.

［2］Andrabi S M，Ansari M S，Ullah N，et al.Duck egg yolk in extender improves the freezability of buffalo bull spermatozoa［J］.Animal Reproduction Seience，2008，104（2）：427-433.

［3］Leeuw，Haring，Kaal-Lansbergen，et al.Fertility results using bovine semen cryopreserved with extenders based on egg yolk and soy bean extract［J］.Theriogenology，2000，54（4）：57-67.

［4］Thun，Maria Hurtado，Janett，et al.Comparison of Biociphos-Plus and TRIS-egg yolk extender for cryopreservation of bull semen［J］.Theriogenology，2002，57（3）：1087-1094.

［5］Jian-hong Hu，Qing-wang Li，Gang Li.The cryoprotective effect on frozen-thawed boar semen of egg yolk low density lipoproteins［J］.Asian-Aust J Anim Sci，2006，19（4）：486-494.