劉 洋 張麗華 薄 艷

1.吉林省吉林市中心醫(yī)院藥學(xué)部，吉林吉林132002；2.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林吉林132013

中藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣直接影響著中藥的質(zhì)量和療效。許多研究建立了一系列有效評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的方法，其鑒定標(biāo)準(zhǔn)也從最初僅有性狀，逐漸增加了顯微、理化、色譜、光譜等方法[1]。但是，對(duì)一部分藥材，例如鹿鞭，僅以上述方法難以達(dá)到鑒定目的。因此人們不斷研究更完善、更準(zhǔn)確、更具科學(xué)性的方法來(lái)解決藥材鑒定問(wèn)題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，特別是微量DNA提取技術(shù)和PCR技術(shù)的發(fā)展，從藥材中提取微量DNA進(jìn)行分析，為用DNA分析技術(shù)鑒定藥材提供了可能。鹿鞭（Testis et penis cervi）乃名貴藥材，系鹿科動(dòng)物梅花鹿（Cnippon temminck）、馬鹿（CelaphusL.）的雄性外生殖器。功效是補(bǔ)腎、壯陽(yáng)、益精。常見(jiàn)偽品牛鞭，兩者性狀相似。市場(chǎng)上經(jīng)常以牛鞭充當(dāng)鹿鞭，較難區(qū)分。本實(shí)驗(yàn)采用分子生物學(xué)方法，進(jìn)行鹿鞭的DNA鑒定。

1 樣本

新鮮梅花鹿鞭1個(gè)，500 g。新鮮馬鹿鞭1個(gè)，1000 g。由長(zhǎng)白山野生生物資源重點(diǎn)野外觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站提供。新鮮部分牛鞭1個(gè)，600 g，由吉林市牛馬行農(nóng)貿(mào)大廳購(gòu)買。

2 方法

2.1 新鮮品鹿鞭及牛鞭mtDNA的PCR鑒定

采用堿變性法提取并純化新鮮品和中藥材鹿鞭與牛鞭的mtDNA[2]。采用軟件Primer Premier5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，Oligo 6.0進(jìn)行驗(yàn)證。由上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游引物 5’-CCCTCAGAATGATTGTCCTCA-3’，下游引物 5’-ATCCAACATCACAGCATGATG-3’。以提取的新鮮品鹿鞭及牛鞭mtDNA為模板，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：94℃5 min，94℃30 sec，58℃ 30 sec，72℃ 30 sec，72℃ 10 min。新鮮品梅花鹿鞭、馬鹿鞭、牛鞭的擴(kuò)增產(chǎn)物各取6 μL，加2μL 6×loading Buffer，點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠中，以1×TBE為緩沖液，DNA MarkerⅠ為DNA Mark，70 v電壓，進(jìn)行電泳。30 min后，EB染色，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察和分析結(jié)果。

2.2 序列分析

2%瓊脂糖凝膠電泳分離新鮮品鹿鞭的目的片段，片段回收，上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。測(cè)序結(jié)果按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)[2]。

3 結(jié)果

3.1 新鮮品鹿鞭的PCR鑒定

以新鮮品梅花鹿鞭、馬鹿鞭及牛鞭線粒體DNA為模板，加入鹿鞭特異性引物后，梅花鹿鞭、馬鹿鞭可擴(kuò)增出306bp大小的目的基因片段，牛鞭未能擴(kuò)增出相應(yīng)的基因片段。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 新鮮品鹿鞭的PCR鑒定結(jié)果圖

3.2 鹿鞭Cytb基因片段的序列分析

本研究中所測(cè)鹿鞭的線粒體Cytb序列與GenBank中梅花鹿鞭的序列同源性為99%，與牛鞭線粒體Cytb無(wú)同源性。

4 討論

鹿鞭為名貴中藥材，價(jià)格高，市場(chǎng)上屢見(jiàn)偽品，其鑒定研究主要集中在藥材的性狀鑒別和化學(xué)分析兩方面。本實(shí)驗(yàn)采用堿變性改良法，可提取出1 5800 bp完整的鹿鞭mtDNA。同時(shí)，以提取的鹿鞭mtDNA 作模板，設(shè)計(jì)線粒體Cyt b基因特異引物可擴(kuò)增306 bp片段，而以牛鞭為模板未擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，測(cè)序結(jié)果顯示，Cyt b基因的306 bp片段序列與GenBank中梅花鹿及馬鹿鞭的序列同源性為99%。說(shuō)明這對(duì)Cytb基因特異性引物可作為鹿鞭鑒定指標(biāo)之一[3-7]。

從本研究結(jié)果來(lái)看，將分子遺傳學(xué)技術(shù)引入到組織、器官類的動(dòng)物藥材的檢驗(yàn)中是可行的，顯示用以上技術(shù)鑒定動(dòng)物藥材的有效性和可靠性。

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