尹召華王夢(mèng)芝王洪榮張 潔喻禮懷

(1.揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)，揚(yáng)州 225009;2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

瘤胃微生物在反芻動(dòng)物消化生理中至關(guān)重要。碳水化合物在反芻動(dòng)物瘤胃中被微生物降解為揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，VFA可提供機(jī)體可消化能的70% ～80%［1］。VFA包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和己酸等。乙酸、丙酸和丁酸約占瘤胃發(fā)酵VFA總產(chǎn)量的95%，也是機(jī)體代謝最為重要的幾種VFA。丁酸在瘤胃液中含量相對(duì)較低(10%左右)，而且可由乙酸轉(zhuǎn)化;乙酸和丙酸是飼料在瘤胃內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生的兩大主要有機(jī)酸，飼料的種類和微生物的區(qū)系不同，發(fā)酵產(chǎn)生乙酸與丙酸比(乙/丙)也不同，如非結(jié)構(gòu)性碳水化合物在瘤胃中的發(fā)酵率很高，產(chǎn)生VFA總量也較多，但乙/丙較低，而粗飼料則相反。因此，瘤胃液乙/丙可反映飼料在瘤胃中的發(fā)酵模式;同時(shí)，VFA又為微生物發(fā)酵底物和合成微生物蛋白質(zhì)(MCP)提供能量和碳架。鑒于微生物生長(zhǎng)對(duì)底物的選擇性［1］，乙/丙也會(huì)影響微生物蛋白質(zhì)的合成以及不同區(qū)系瘤胃微生物(細(xì)菌、原蟲等)的群體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響整個(gè)機(jī)體的消化與營(yíng)養(yǎng)代謝［2］。迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未見通過(guò)體外培養(yǎng)研究乙/丙影響瘤胃微生物VFA發(fā)酵模式以及原蟲、細(xì)菌群體多樣性的報(bào)道。為此，本研究設(shè)置4種乙/丙進(jìn)行人工模擬瘤胃體外發(fā)酵試驗(yàn)，旨在研究瘤胃液乙/丙對(duì)微生物發(fā)酵模式及群體多樣性的影響，以期為反芻動(dòng)物瘤胃微生物營(yíng)養(yǎng)代謝調(diào)控的研究提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 供瘤胃液動(dòng)物及瘤胃液的采集

試驗(yàn)在揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)進(jìn)行。選用4只健康、體重(37.6 ±1.3)kg、安裝有永久性瘤胃瘺管的徐淮山羊羯羊作為瘤胃液供體。單圈飼養(yǎng)，以(玉米+豆粕)∶羊草為30∶70作為飼糧，日給料干物質(zhì)質(zhì)量為體重的2%，08:00和20:00分2次等量飼喂，自由飲水。

通過(guò)瘤胃瘺管，利用自制真空負(fù)壓裝置，在晨飼前從4頭山羊瘤胃內(nèi)各采約150 mL瘤胃液，過(guò)4層紗布，濾液裝于預(yù)先通有CO2并39℃預(yù)熱的滅菌生理鹽水瓶中，將所有瘤胃液混合均勻，39℃水浴保溫送回實(shí)驗(yàn)室待用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)按培養(yǎng)底物乙/丙不同分為4組，A、B、C和 D 組乙/丙分別為 30∶70、50∶50、70∶30、100∶0，各組能量水平一致。

1.3 體外培養(yǎng)

培養(yǎng)底物配制方法如下:體外培養(yǎng)試驗(yàn)開始前30 min，按表1的體積取乙酸和丙酸溶于20 mL水中，用1 mol/L NaOH調(diào)pH為7.0，再加人工唾液鹽(配制參考 Menke等［3］的方法)至80 mL為乙酸、丙酸混合液，39℃水浴待用。

三角瓶經(jīng)紫外線滅菌30 min后加入1 g酪蛋白;再在各瓶中分別加入按不同比例混合好的乙酸、丙酸混合液80 mL(預(yù)先通CO2至飽和、39℃預(yù)熱);而后加入瘤胃液40 mL;塞好橡皮塞，通CO2、39℃、震蕩(50 r/min)培養(yǎng)。每組各設(shè)3個(gè)重復(fù)，另設(shè)1個(gè)不加底物的(僅含瘤胃液、人工唾液鹽)空白對(duì)照。體外培養(yǎng)方法參照Menke等［3］的方法進(jìn)行。

表1 培養(yǎng)底物的組成及能量水平Table 1 Composition and energy levels of cultural substrates

1.4 樣品采集

分別在培養(yǎng)后 2、4、6、8、10、12、16 和 24 h 各采集2 mL培養(yǎng)液，并－20℃冷凍保存，用于培養(yǎng)液VFA濃度的測(cè)定。培養(yǎng)結(jié)束后，取10 mL培養(yǎng)液分裝2個(gè)離心管，其中1管用于分離培養(yǎng)液的原蟲與細(xì)菌，分離后采用二苯胺顯色法測(cè)定細(xì)菌、原蟲的DNA含量;另1管用于微生物DNA的提取，提取得到的DNA進(jìn)行群體多樣性檢測(cè)。

1.5 VFA 濃度測(cè)定

采用日本島津GC－14B氣相色譜儀按文獻(xiàn)［4］的方法進(jìn)行測(cè)定。

色譜條件:毛細(xì)管柱CP-WAX(30 m×0.53 mm ×1 μm);氣化室 200 ℃，F(xiàn)ID 檢測(cè)器200℃;柱溫采用程序升溫法，初溫100℃，末溫150℃，升溫速率3℃/min，靈敏度為10，衰減為25;以巴豆酸為內(nèi)標(biāo)物。

培養(yǎng)液處理:培養(yǎng)液經(jīng)15 000×g離心10 min后取上清液1 mL，加0.2 mL 20%含60 mmol/L巴豆酸的偏磷酸，混勻后高速離心取上清液0.4 μL進(jìn)樣分析。

1.6 微生物分離及其DNA濃度測(cè)定

培養(yǎng)液微生物采用文獻(xiàn)［5］的方法進(jìn)行分離。1)原蟲:取培養(yǎng)液加等體積生理鹽水39℃水浴震蕩(125 r/min)培養(yǎng)60 min，并輔以攪拌;再經(jīng)4層紗布過(guò)濾，濾液離心(150×g、10 min)，收集沉淀為原蟲，用生理鹽水洗滌2次后用生理鹽水懸浮，－20℃貯存待測(cè)。2)細(xì)菌:收集離心后的上清液，再高速離心(15 000×g、15 min)，收集沉淀為細(xì)菌，其余處理同原蟲。

微生物DNA濃度測(cè)定采用二苯胺顯色法、參照趙亞華［6］的步驟。制備小牛胸腺DNA鈉鹽(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制以DNA濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取分離后的原蟲或細(xì)菌樣品，調(diào)整至線性范圍濃度后，2 mL樣品加4 mL二苯胺試劑于60℃水浴中保溫1 h，使用722N型分光光度計(jì)(上海精科)測(cè)定OD595nm。計(jì)算公式:

DNA濃度(mg/mL)=根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得樣品

DNA濃度×稀釋倍數(shù)×10－3。

1.7 微生物遺傳指紋分析

1.7.1 DNA 的提取

采用Zhou等［7］的凍融法提取細(xì)菌、原蟲的DNA。采用756型紫外分析儀(天津普瑞斯)測(cè)定所提取DNA的濃度和純度，0.7%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA片段大小。

1.7.2 PCR

細(xì)菌用細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)兼并引物F338與 R518進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增［8］;原蟲用纖毛蟲rDNA的 ITS1區(qū)兼并引物 F1738與 R1951進(jìn)行PCR擴(kuò)增［9］，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表2 瘤胃微生物引物序列及參數(shù)Table 2 Sequences and parameters of primers of rumen microbes

1.7.3 單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)檢測(cè)與圖譜分析

SSCP檢測(cè)參考 Schmalenberger等［10］的方法，圖譜分析參照 Carriqo等［11］的方法。將 SSCP圖譜數(shù)字化，計(jì)算泳道(底物)間Jaccard相似性指數(shù)(Cj)，公式為:

式中:j為2個(gè)泳道共有條帶數(shù);a和b為2個(gè)泳道各自特有的帶數(shù)。Cj反映了群落間物種組成的相似性，本文中用Cj代表2個(gè)泳道(樣品)的組帶分布(即微生物群體結(jié)構(gòu))的相似程度。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行整理，用SPSS 16.0軟件中的One-way ANOVA過(guò)程進(jìn)行分析和Tukey法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 底物乙/丙對(duì)培養(yǎng)液VFA濃度的影響

由表3可見，A、B、C和D組乙酸濃度平均值分別為 12.02、11.41、13.76 和 17.81 mmol/L。D組乙酸濃度最高(P＜0.05)，顯著高于其他3組。其次為C、A組，B組最低。A、B、C和D組丙酸濃度平均值分別為6.50、4.36、4.40 和5.62 mmol/L，可見A組丙酸濃度最高、B組最低(P＜0.05)。A、B、C 和 D 組丁酸濃度平均值分別為 3.33、2.26、1.88和2.18 mmol/L，其中A和C組間差異顯著(P ＜0.05)。

從動(dòng)態(tài)變化來(lái)看，各種VFA濃度變化趨勢(shì)相似，隨時(shí)間延長(zhǎng)基本都呈上升趨勢(shì)。C、D組中乙酸濃度明顯隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增加，而A、B組則變化較為平緩，A組在16～24 h階段有所下降。B組的丙酸濃度在培養(yǎng)后2 h時(shí)高于其他3組，而后與其他組一樣，基本呈現(xiàn)上升趨勢(shì);A組丙酸濃度除2 h外基本持續(xù)在較高水平變化，但在16～24 h階段也有所下降。丁酸濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的變化規(guī)律和丙酸的變化趨勢(shì)類似。

2.2 底物乙/丙對(duì)培養(yǎng)液該比例及原蟲和細(xì)菌DNA濃度的影響

由表4可見，各組培養(yǎng)液乙/丙平均值在3∶1左右，大致呈現(xiàn)出隨底物乙/丙升高而升高的規(guī)律，而且A組顯著低于C和D組(P＜0.05)。從動(dòng)態(tài)變化來(lái)看，培養(yǎng)液乙/丙隨時(shí)間的波動(dòng)變化較為平緩。細(xì)菌DNA濃度以B組最高、C和D組次之，A組最低;原蟲DNA濃度以B組最高、A組次之，均顯著高于C和D組(P＜0.05)。

表3 底物乙/丙對(duì)培養(yǎng)液VFA濃度的影響Table 3 Effects of acetate to propionate ratio of substrates on concentrations of volatile fatty acids in the culture medium mmol/L

2.3 細(xì)菌和原蟲SSCP圖譜分析

圖1為瘤胃細(xì)菌、原蟲區(qū)系的SSCP圖譜，圖譜上的條帶反映了不同底物下培養(yǎng)液中的優(yōu)勢(shì)菌群，條帶的數(shù)量和位置的復(fù)雜性說(shuō)明了菌群的多樣性。由細(xì)菌SSCP圖譜可見，B組條帶數(shù)最多為16條，D組條帶數(shù)最少為5條，A、B、C和D組都有2條共有的優(yōu)勢(shì)條帶a和b;另外的2條優(yōu)勢(shì)帶c和d為B和C組共有，而A和D組沒(méi)有。Jaccard相似性指數(shù)表明，B和C組的細(xì)菌圖譜相似性較高(0.52)，圖譜中有10條共有條帶。

由原蟲的SSCP圖譜可見，D組條帶數(shù)最多為17條，A組條帶數(shù)最少為10條。B和C組分別為12、11條，但B和C組條帶灰度明顯高于 D組。A、B、C和D組共有2條優(yōu)勢(shì)條帶 e和f。原蟲SSCP指紋圖譜也以B和C組間相似性指數(shù)較高(0.50)。

表4 底物乙/丙對(duì)培養(yǎng)液該比例和微生物DNA濃度的影響Table 4 Effects of acetate to propionate ratio of substrates on the ratio and microbes DNA concentration of culture medium

表5 瘤胃細(xì)菌、原蟲的相似性指數(shù)矩陣Table 5 The matrix of kindred index for rumen bacteria and protozoa

3 討論

乙酸是反芻動(dòng)物代謝所需能量的主要來(lái)源。丙酸則是反芻動(dòng)物重要的葡萄糖前體，丙酸型發(fā)酵能為機(jī)體提供更多的能量，因而乙/丙影響能量的利用率［12］;同時(shí)，乙酸通過(guò)葡萄糖經(jīng)磷酸戊糖途徑代謝和葡萄糖存在依賴關(guān)系。因此，通過(guò)調(diào)整乙/丙可提高能量利用率。VFA既是碳水化合物在瘤胃的終產(chǎn)物，也是瘤胃微生物生長(zhǎng)所需的重要碳架和能量來(lái)源。乙酸和丙酸通過(guò)不同的代謝途徑提供瘤胃微生物生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，乙/丙不同，瘤胃微生物的群體結(jié)構(gòu)也可能不同，進(jìn)而又導(dǎo)致發(fā)酵模式的不同，改變發(fā)酵產(chǎn)物乙/丙?？梢?，底物與微生物間存在復(fù)雜的互作關(guān)系。

本研究表明，培養(yǎng)液乙酸濃度以100∶0組最高、丙酸濃度以30∶70組最高，這可能是由于100∶0組底物中乙酸濃度較高、而30∶70組底物中丙酸較高，進(jìn)而導(dǎo)致利用和代謝相應(yīng)酸的某些種類微生物增加，而使培養(yǎng)液中相應(yīng)酸的比例較高所致。而培養(yǎng)液乙酸和丙酸濃度皆以50∶50組最低，這可能是由于該組微生物活性較高，生長(zhǎng)繁殖較快對(duì)底物的利用較多所致。這與本文所測(cè)定的細(xì)菌、原蟲DNA濃度在50∶50組最高相一致。另外，該結(jié)果也與反映微生物多樣性的圖譜有一定的一致性。例如50∶50組細(xì)菌SSCP圖譜條帶數(shù)最多;50∶50組原蟲的條帶數(shù)僅次于100∶0組，而且該組圖譜中的條帶灰度明顯高于100∶0組。這些結(jié)果表明50∶50組細(xì)菌、原蟲群體較為多樣，而且群體量也較大［13］。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌、原蟲的 SSCP圖譜組間相似程度各有差異，但都以50∶50和70∶30組圖譜間相似性指數(shù)較高，表明了在一定的比例范圍內(nèi)，底物接近則微生物的群體結(jié)構(gòu)也相近。以上結(jié)果說(shuō)明底物對(duì)微生物有一定的影響，可以通過(guò)底物或飼糧的改變來(lái)調(diào)控微生物的代謝，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體消化代謝，與前人的研究有一定的一致性［14－15］。例如 Tajima 等［16］曾研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦奶牛的飼糧從粗飼料突然轉(zhuǎn)變?yōu)楦呔锨闆r下，瘤胃球菌消失，而乳酸利用菌成為優(yōu)勢(shì)菌群;王夢(mèng)芝等［9］報(bào)道的蛋白源不同微生物的種群結(jié)構(gòu)也不同。

圖1 瘤胃細(xì)菌和原蟲區(qū)系的SSCP分析Fig.1 SSCP analysis of rumen bacteria and protozoa

動(dòng)物采食飼料后，淀粉以及可溶性碳水化合物在瘤胃中發(fā)酵產(chǎn)生VFA的速度較快，VFA的濃度增加。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，瘤胃上皮對(duì)VFA吸收的增加及向后部消化道流出速度的加快，引起瘤胃中VFA的濃度又開始下降。而與體內(nèi)研究不同的是，本批次培養(yǎng)為不連續(xù)培養(yǎng)，作為不連續(xù)發(fā)酵裝置，其產(chǎn)生的VFA不能夠被瘤胃壁吸收和通過(guò)后部消化道排出，因此隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，本試驗(yàn)記錄的VFA的產(chǎn)量逐漸升高。但在一定的范圍內(nèi)，培養(yǎng)液具有一定的緩沖能力，不影響微生物的正常發(fā)酵［17］。而且除了VFA被吸收或排出，培養(yǎng)液乙酸、丙酸的濃度也反映了發(fā)酵和微生物對(duì)VFA的利用情況，所以常常被用來(lái)進(jìn)行機(jī)理研究。至于乙/丙對(duì)瘤胃中微生物群體結(jié)構(gòu)等影響還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

①底物乙/丙為100∶0時(shí)培養(yǎng)液乙酸濃度最高，30∶70 時(shí)丙酸濃度最高，50∶50 時(shí)乙酸、丙酸濃度均為最低。

②細(xì)菌、原蟲SSCP圖譜組間相似程度不同，底物乙/丙為50∶50和70∶30時(shí)圖譜間相似程度最高。

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