王永玲 王文娟 宋 霖 蔡春芳 葉元土 孔 麗

魚(yú)粉是一種理想的動(dòng)物蛋白源，是水產(chǎn)動(dòng)物最重要的飼料原料。然而全球魚(yú)粉資源正日漸衰退，大量使用魚(yú)粉對(duì)環(huán)境的負(fù)面影響也較大（Cowey等，1991），因此應(yīng)該限制魚(yú)粉用量，尋找水產(chǎn)飼料中魚(yú)粉的適宜替代品。

植物蛋白源資源豐富，用植物蛋白源替代魚(yú)粉的研究報(bào)道也很多。許多研究表明，豆粕替代魚(yú)粉后會(huì)引起魚(yú)類腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，使魚(yú)易患類似非感染性腸炎。而關(guān)于鯉魚(yú)（Uran等,2008）、鯽魚(yú)（張偉等，2010）的研究表明，這種腸道形態(tài)的變化在攝食3周后會(huì)消失。腸道是直接接觸飼料并且敏感的器官，因此，其形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能變化可用于評(píng)判飼料優(yōu)劣。本研究以異育銀鯽腸道為靶器官，研究豆粕、花生粕、菜籽粕、棉籽粕四種植物蛋白源及其不同比例替代魚(yú)粉飼養(yǎng)不同時(shí)間后腸道形態(tài)的變化，以評(píng)價(jià)四種植物性飼料蛋白源對(duì)異育銀鯽的適用性，為實(shí)用配方設(shè)計(jì)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

參照異育銀鯽實(shí)用飼料配方，以白魚(yú)粉為主要蛋白源，魚(yú)油和豆油為主要脂肪源配制基礎(chǔ)飼料（FM）作為對(duì)照組。選用豆粕（SBM）、花生粕（PM）、菜籽粕（RM）、棉籽粕（CM）四種植物蛋白源分別替代25%和50%的魚(yú)粉，配制成8種試驗(yàn)飼料。飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)魚(yú)及分組

表1 試驗(yàn)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)成分

異育銀鯽購(gòu)自江蘇溧陽(yáng)，為當(dāng)年池塘養(yǎng)殖魚(yú)種。經(jīng)一周馴養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境后，選取大小均勻、體格健壯，約25 g的魚(yú)種，隨機(jī)分配到27個(gè)70 cm×80 cm×100 cm的玻璃鋼水族箱中，每箱20尾。各試驗(yàn)組按完全隨機(jī)化配置法分布以避免位置的差異造成的試驗(yàn)誤差。

1.3 飼養(yǎng)管理

每種飼料投喂3箱鯽魚(yú)，每天投喂量視魚(yú)的攝食情況而定，適量投喂，投喂時(shí)間分別為8：30、12：30、17：00。詳細(xì)記錄每天的攝食量。所有水族箱在同一半開(kāi)放式循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，自然光周期，以充分曝氣的自來(lái)水為水源，每天換水量為總水量的1/3。養(yǎng)殖水經(jīng)過(guò)濾、沉淀后流回蓄水池，經(jīng)過(guò)增氧、控溫后由水泵抽回各水族箱。養(yǎng)殖期間水質(zhì)條件為：水溫(25±2)℃，DO＞6.0 mg/l，pH 值 7.5±0.2，NH3-N 濃度為(0.25±0.05)mg/l，NO2-N 濃度為(0.04±0.01)mg/l，硫化物＜0.05 mg/l，各項(xiàng)指標(biāo)均符合養(yǎng)殖水體要求。飼養(yǎng)期自2010年8月25日至2010年10月24日，共進(jìn)行8周。

1.4 采樣與分析方法

分別于2周、3周、5周、8周末從各水族箱隨機(jī)取試驗(yàn)魚(yú)3尾，使用MS-222將魚(yú)麻醉。取出內(nèi)臟，分離出腸道，剔除表面脂肪組織，分別取前腸和后腸組織在生理鹽水中洗滌，除去其上所帶有的血液、糞便等雜質(zhì)，放入波恩氏液中固定。制樣時(shí)將其取出，分別經(jīng)濃度為70%、80%、90%、95%和100%的乙醇梯度脫水，并置于二甲苯中透明，最后包埋于低熔點(diǎn)石蠟中。使用KD-2508型切片機(jī)橫向連續(xù)切片，厚度為6 μm，而后展片于清潔的載玻片上，采用H.E染色，中性樹(shù)膠封片。光鏡觀察皺襞（F）高度、黏膜（S）下層和肌層（M）厚度，以及柱狀上皮細(xì)胞內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0軟件，數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析后用Duncan's法多重比較，顯著水平為0.05。

2 試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖1及表2～表5)

圖1 黏膜下層富含淋巴細(xì)胞的區(qū)域?yàn)榱馨图?xì)胞層

表2 試驗(yàn)飼料投喂2周后異育銀鯽前腸、后腸組織形態(tài)（μm）

表3 試驗(yàn)飼料投喂3周后異育銀鯽前腸、后腸組織形態(tài)（μm）

表4 試驗(yàn)飼料投喂5周后異育銀鯽前腸、后腸組織形態(tài)（μm）

表5 試驗(yàn)飼料投喂8周后異育銀鯽前腸、后腸組織形態(tài)（μm）

光鏡分析可見(jiàn)，異育銀鯽腸道皺襞由前向后逐漸縮短，肌層由前向后逐漸變?。火つは聦痈缓馨图?xì)胞的區(qū)域?yàn)榱馨图?xì)胞層（見(jiàn)圖1）。2周和3周時(shí)，肌層厚度各組間前、后腸均無(wú)顯著差異（表 3）；5周時(shí)，SBM50組、RM 組前、后腸肌層厚度均顯著低于FM組(P＜0.05)；8周時(shí)，SBM50組、RM組、CM50組前、后腸肌層厚度均顯著低于FM、SBM25和PM25 組(P＜0.05)。

2周和3周時(shí)，皺襞高度各組間前、后腸均無(wú)顯著差異(P＞0.05)；5周時(shí)，CM50組前腸顯著低于FM組(P＜0.05)，后腸各組差異均不顯著(P＞0.05)；8 周時(shí)，各組間前腸、后腸差異均不顯著。

黏膜下層厚度各組間無(wú)顯著差異。

5周時(shí)，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)度SBM50前腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞大大高于FM組，RM組和CM50組后腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞也有增多，8周時(shí)，RM25、RM50和CM50組后腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞量高于FM組。

3 討論

魚(yú)類腸道是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場(chǎng)所，黏膜皺襞的高低和疏密、上皮細(xì)胞的高低、紋狀緣的發(fā)達(dá)程度以及杯狀細(xì)胞數(shù)量的多少等與消化吸收能力密切相關(guān)（婁允東，2000）。Burrells等（1999）研究表明，豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子可導(dǎo)致大西洋鮭和虹鱒腸黏膜發(fā)生病理變化和非特異性免疫能力下降。Pongmaneerat等（1992）研究表明，飼料中豆類產(chǎn)品添加量超過(guò)50%即可導(dǎo)致虹鱒腸黏膜損傷加大、液泡種類和數(shù)量上升、亞黏膜炎癥反應(yīng)的增加。Refstie S等(2001)、Ksudhik等(2004)分別在虹鱒、歐洲真鱸的飼料中添加一定量的大豆蛋白，發(fā)現(xiàn)后腸絨毛上皮結(jié)構(gòu)發(fā)生形態(tài)變化，黏膜褶縮短、黏膜固有層加深加寬。但有關(guān)菜粕、棉粕、花生粕對(duì)腸道影響的研究較少。本試驗(yàn)中，異育銀鯽日糧中添加植物蛋白源后，隨著飼養(yǎng)周期的延長(zhǎng)，各種植物蛋白源均在一定程度上對(duì)異育銀鯽的腸道結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，特別是高含量組。其中，尤以棉籽粕和菜籽粕造成的影響較大，豆粕和花生粕次之。結(jié)果提示我們，各種植物蛋白源在鯽魚(yú)飼料中適宜添加量的研究除了要考評(píng)生長(zhǎng)效果外，還應(yīng)考察其生理影響。有些植物蛋白源即使對(duì)生長(zhǎng)沒(méi)產(chǎn)生顯著影響，也可能使魚(yú)類處于亞健康狀態(tài)，最終影響?zhàn)B殖效果。本試驗(yàn)結(jié)果表明，豆粕和花生粕是鯽魚(yú)較好的植物蛋白源，棉籽粕和菜籽粕次之。異育銀鯽日糧中，菜籽粕在配方中的比例不宜超過(guò)25%。豆粕、棉粕和花生粕作為單一植物蛋白源添加時(shí)，在配方中的比例不宜占到50%。

Uran等（2008）報(bào)道，當(dāng)飼料中20%的蛋白質(zhì)由動(dòng)物蛋白變?yōu)槎蛊蓵r(shí)，鯉魚(yú)攝食1周后即表現(xiàn)出腸炎癥狀，而在3周時(shí)癥狀比較嚴(yán)重，表現(xiàn)出了皺襞縮短、上皮細(xì)胞核上空泡消失、杯狀細(xì)胞數(shù)量增加、固有層變寬、黏膜下層嗜堿性粒細(xì)胞增加、下皮細(xì)胞吞噬能力下降等癥狀。但在第4～5周時(shí)就觀察到自行恢復(fù)現(xiàn)象。張偉等（2010）也觀察到鯽魚(yú)攝食含30%豆粕的飼料后3周出現(xiàn)明顯的腸道形態(tài)變化，但8周時(shí)癥狀消失。本試驗(yàn)中未在3周時(shí)觀察到鯽魚(yú)腸道形態(tài)學(xué)變化，但在5周后觀察到不同處理間有顯著差異。植物蛋白源對(duì)腸道形態(tài)影響的作用規(guī)律和機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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