倪晨 王貴均 王倩 賴(lài)小平

腎小球硬化(glomerulosclerosis，GS)是腎小球疾病發(fā)展至終末期，腎功能衰竭的主要病理改變。其中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解減少、過(guò)度積聚，是GS的重要發(fā)病機(jī)制[1,2]。在ECM降解調(diào)控系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的是基質(zhì)金屬蛋白酶MMP和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物TIMP[3](MMPs-TIMPs)系統(tǒng)，隨著TIMP-1表達(dá)增強(qiáng)，MMP-9降解作用減弱，MMP-9/TIMP-1的比值失調(diào)，最終形成腎小球硬化。此外，細(xì)胞因子在GS的形成過(guò)程中也起著非常關(guān)鍵的作用，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子[4]TGF-β1的調(diào)控作用尤為重要。TGF-β1既能促進(jìn)ECM合成增加，又能抑制ECM的降解，最終導(dǎo)致ECM聚積，形成腎小球硬化。本研究基于腎絡(luò)癥積理論，采用祛瘀化痰、散結(jié)消癥的治療方法，配伍川芎、鱉甲、海藻[6-8]，考察祛瘀化痰、散結(jié)消癥中藥復(fù)方對(duì)腎小球硬化大鼠腎功能的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器

超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)harris公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIORAD smartspec 3000型)，電子精密天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，熒光定量PCR儀(ABI 7300)、Effendorf 冷凍離心機(jī)。

1.2 試藥

川芎、鱉甲、海藻，購(gòu)自康美藥業(yè)股份有限公司。經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定后使用。稱(chēng)取川芎、鱉甲、海藻各20 g，分別置于1000 ml圓底燒瓶中，以10倍量水回流提取兩次，每次1.5小時(shí)，濾過(guò)，洗滌濾渣，合并兩次過(guò)濾液和洗滌液，濃縮至1.5 g·ml-1、1.0 g·ml-1、0.5 g·ml-1，分別為高、中、低濃度藥液，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

鹽酸阿霉素，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：09015，臨用前用生理鹽水配制為1 mg·ml-1；福辛普利鈉片，施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：H20090262，粉碎后用蒸餾水配制成0.33 g·ml-1的溶液。MMP-9酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒、TIMP-1酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒(美國(guó)RB公司)、First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)。

1.3 動(dòng)物分組、造模與給藥

SD大鼠，60只，雌雄各半，180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(粵檢證字2009A028)。

隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、福辛普利鈉組、高、中、低濃度中藥組等6組，每組10只。各組動(dòng)物腹腔注射2%戊巴比妥鈉30 mg·kg-1麻醉，摘取左腎[5]，空白對(duì)照組假手術(shù)。

各組動(dòng)物手術(shù)后7天，尾靜脈注射阿霉素5 mg·kg-1，20天后再給阿霉素3 mg·kg-1造模，空白對(duì)照組注射等體積生理鹽水。

各組于第2次注射阿霉素后1天，按1 ml·100g-1·d-1灌胃，空白對(duì)照組及模型組給同體積蒸餾水，福辛普利鈉組給福辛普利鈉，各中藥組給相應(yīng)濃度藥液，共給藥8周。

1.4 24小時(shí)尿蛋白定量檢測(cè)

各組于第2、4、6、8周結(jié)束時(shí)收集24小時(shí)尿液，溴甲酚氯仿法測(cè)定24小時(shí)尿蛋白定量。

1.5 MMP-9、TIMP-1檢測(cè)

各組動(dòng)物于末次給藥1小時(shí)后，斷頭取血，常規(guī)方法取血清，另開(kāi)腹腔取腎臟。

MMP-9的檢測(cè)：取上述各組血清，按 MMP-9 ELISA試劑盒要求操作，培養(yǎng)板各孔加100 μl Assay Diluent RD1-34，每孔加100 μl標(biāo)準(zhǔn)品、樣品，孵育2小時(shí)，棄去上清，400 μl Buffer洗液·孔-1，清洗4次，加MMP-9二抗孵育1小時(shí)，棄去上清，400 μl Buffer洗液·孔-1，清洗4次。每孔加顯色液200 μl，避光室溫孵育30 分鐘，加終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度OD值。

TIMP-1的檢測(cè)：取上述各組血清，按酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒要求操作，將TIMP-1 McAb分別滴加在培養(yǎng)板孔內(nèi)，100 μl·孔-1，4℃過(guò)夜后棄去上清，用0.05%(V/V)Tween-20PBS(PBST)洗板3次，每次3分鐘；拍干后加含15%小牛血清的PBS，200 μl·孔-1，4℃過(guò)夜后棄去上清，PBST洗滌3次，每次3分鐘。將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品加于包被孔內(nèi)，37℃孵育1小時(shí)，PBST洗板5次，拍干后加HRP-抗TIMP-1二抗100 μl·孔-1，37℃孵育30分鐘，PBST洗板5次，徹底拍干后加入TMB顯色劑，50 μl·孔-1，37℃孵育15分鐘，加2 mol H2SO4 50 μl·孔-1終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度OD值。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞TGF-β1mRNA

1.6.1 總RNA提取

取100 mg腎臟組織，按試劑盒要求操作，加入TRIzol反復(fù)吹打裂解細(xì)胞，用氯仿、異丙醇、75%乙醇分離、純化 RNA，最后用DEPC水溶解，紫外分光光度法檢測(cè)總RNA濃度及純度，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

反應(yīng)體系為20 μl，各組分終濃度分別為dNTP 1 mmol·L-1、Oligo(dT)18引物2.5 nmol·L-1、M-MlV逆轉(zhuǎn)錄酶10 U·μl-1、總RNA樣品0.2 ng～200 ng，DEPC水加至20 μl；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)為70℃孵育30分鐘，冰上放置2分鐘，37℃孵育5分鐘，42℃孵育60分鐘，70℃孵育10分鐘，所得產(chǎn)物cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.6.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

所用的目的基因引物及內(nèi)參照GAPDH引物均委托 invitrogen 公司合成。引物序列：TGF-β1上游引物5’-tacagggctttcgcttcagt-3’，下游引物5’-gttggtatccagg gctctcc-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度 209 bp；GAPDH上游引物5’-ctcccattcctccacctttg-3’，下游引物5’-ccaccaccctgttgctgtag-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度 110 bp。反應(yīng)體系為20 μl：2 μl cDNA，1 μl SYBR Green I 熒光染料，1 mmol dNTP，1μmol·L-1上、下游引物，5U·μl-1Taq酶，DEPC水加至20 μl，混勻。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸20秒，熱循環(huán)40次，72℃延伸5分鐘。

1.6.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析方法

按照2-△△Ct相對(duì)定量方法分析，目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100%，具有一致性。△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)，△△Ct=△Ct(處理組)-△Ct(空白對(duì)照組)，取100倍2-△△Ct數(shù)值進(jìn)行比較。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量結(jié)果

各中藥組均能減少腎小球硬化大鼠24小時(shí)尿蛋白(P< 0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠MMP-9、TIMP-1表達(dá)的比較

各中藥組均能有效上調(diào)MMP-9的表達(dá)，下調(diào)TIMP-1的表達(dá)，提高M(jìn)MP-9/ TIMP-1的比值(P< 0.05)，其中中劑量組效果最為顯著(P< 0.01)，見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠TGF-β1 mRNA表達(dá)的比較

各中藥組均能抑制腎小球硬化大鼠TGF-β1mRNA的表達(dá)(P< 0.01)；其中以中劑量組效果最顯著，見(jiàn)表3，圖1。

表1 各組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量比較

表2 各組大鼠MMP-9、TIMP-1表達(dá)的比較

表3 各組大鼠TGF-β1mRNA表達(dá)的比較

圖1 各組大鼠TGF-β1mRNA表達(dá)的比較

3 討論

細(xì)胞外基質(zhì)ECM的降解過(guò)程中發(fā)揮重要作用的是MMPs-TIMPs系統(tǒng)，其中，MMP-9可降解ECM中主要成分，減少ECM沉積，而TIMP-1可抑制MMP-9的降解作用，因此，MMP-9表達(dá)降低或TIMP-1表達(dá)增高，均可使MMP-9/TIMP-1的比值失調(diào)，從而加速腎小球硬化的形成。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1在腎小球硬化的形成過(guò)程中也起著非常關(guān)鍵的作用，TGF-β1既能促進(jìn)ECM合成增加，同時(shí)又抑制ECM的降解，最終導(dǎo)致ECM聚積，形成腎小球硬化。因此，本研究觀察各藥物組對(duì)腎小球硬化大鼠MMP-9、TIMP-1、TGF-β1mRNA的表達(dá)及MMP-9/TIMP-1比值的調(diào)節(jié)，評(píng)價(jià)各組中藥對(duì)ECM降解調(diào)控系統(tǒng)的影響。

中國(guó)古代醫(yī)籍中沒(méi)有“腎小球硬化”的表述，但根據(jù)其發(fā)展過(guò)程中的臨床表現(xiàn)及發(fā)病特點(diǎn)，該病可歸屬于 “水腫”、“虛勞”、“腎勞”、“癃閉”等病癥范疇。該病絡(luò)氣郁滯[9]，瘀血痰濕凝滯腎絡(luò)而致“腎絡(luò)癥積”，腎臟組織的病理改變，如細(xì)胞外基質(zhì)積聚、血管拌閉塞、球囊粘連、局灶或節(jié)段性腎小球硬化等，都可歸屬于“腎絡(luò)癥積”的范疇。

本實(shí)驗(yàn)采用單側(cè)腎切除加注射阿霉素造模法，建立腎小球硬化大鼠模型，實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為蛋白尿和腎功能低下。實(shí)驗(yàn)選取福辛普利鈉作為腎臟保護(hù)的陽(yáng)性對(duì)照組，福辛普利鈉屬于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，通過(guò)抑制血管緊張素Ⅱ的生成、阻斷腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)作用，及抑制緩激肽降解、增強(qiáng)緩激肽效應(yīng)；同時(shí)可以減少尿蛋白排泄等，拮抗腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化而延緩腎損害進(jìn)展。通過(guò)川芎、鱉甲、海藻相互配伍，針對(duì)腎絡(luò)之“痰、瘀、癥積”，在祛瘀、化痰的同時(shí)，配伍散結(jié)消癥之品以增強(qiáng)消癥化積之力，以期“痰瘀同治、癥結(jié)并消”。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示該復(fù)方能減少腎小球硬化大鼠24小時(shí)尿蛋白(P<0.01)，抑制TIMP-1的表達(dá)(P< 0.05)，上調(diào)MMP-9活性(P< 0.05)；中劑量組可同時(shí)下調(diào)TGF-β1mRNA表達(dá)(P< 0.01)；可能通過(guò)對(duì)ECM系統(tǒng)的調(diào)控，產(chǎn)生對(duì)腎小球硬化大鼠腎功能的保護(hù)作用。 綜上所述，“腎絡(luò)癥積”理論指導(dǎo)下的祛瘀化痰、散結(jié)消癥中藥復(fù)方，為中醫(yī)藥臨床治療腎小球硬化，提供新的思路，但仍需進(jìn)一步研究。

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