靳英麗,陳麗波,劉超英,魯繼榮

(吉林大學(xué) 1.白求恩醫(yī)學(xué)院 藥理教研室,吉林 長(zhǎng)春130021;2.中日聯(lián)誼醫(yī)院;3.第一醫(yī)院)

支氣管哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性和慢性氣道炎癥為特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病,多種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子介導(dǎo)了這一炎癥過(guò)程。與哮喘發(fā)病有關(guān)的細(xì)胞因子很多,其中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是哮喘發(fā)病過(guò)程中的重要因素。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化、存活期延長(zhǎng)具有促進(jìn)作用的一類(lèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。Bonini S等[1]在其研究中發(fā)現(xiàn),哮喘患者血清NGF水平增高,且過(guò)敏性哮喘病人血清NGF水平比非過(guò)敏性哮喘病人高。對(duì)過(guò)敏性哮喘小鼠進(jìn)行抗NGF處理,可明顯減輕哮喘引起的氣道高反應(yīng)性。提示在哮喘發(fā)病的機(jī)制中,可能存在NGF與其它炎癥因子的協(xié)同作用,而此類(lèi)協(xié)同的具體過(guò)程和發(fā)生機(jī)制,則有待進(jìn)一步研究。

本研究應(yīng)用抗NGF抗體對(duì)哮喘小鼠模型進(jìn)行處理,研究NGF被動(dòng)性降低對(duì)哮喘小鼠血清及肺組織TNF-α表達(dá)水平的影響,由此探討NGF參與哮喘發(fā)病的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料動(dòng)物:選取30只8-10周齡雌性BALB/c小鼠,體重20-24克,由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室提供。試劑:卵白蛋白(OVA,Sigma公司)、兔抗小鼠β-NGF多克隆抗體及小鼠TNF-αELISA檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物有限公司)、TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV)Ver.1.1及DNA Marker(大連寶生物公司)。設(shè)備:超聲霧化器(德國(guó)百瑞公司)、水平電泳儀和酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)、PCR儀(AB-2700型)(基因公司)、凝膠圖像分析系統(tǒng)(UVI公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備取30只8-10周齡雌性BALB/c小鼠,隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組、哮喘組、NGF阻斷組,每組 10只。(1)哮喘組:于實(shí)驗(yàn)第1 d、第14 d致敏,即卵白蛋白 20 μ g由 1mg氫氧化鋁乳化,總體積200 μ l,腹腔注射。在第21～27 d,以超聲霧化器霧化3%OVA鹽水氣溶膠吸入激發(fā),每天1次,每次30 min。(2)NGF阻斷組:哮喘模型建立同哮喘組,但于每次激發(fā)前3 h,先經(jīng)鼻滴入抗小鼠β-NGF 抗體(稀釋度 1∶50)50 μ l。(3)正常對(duì)照組:在每次霧化及腹腔注射時(shí)均以等量生理鹽水應(yīng)用對(duì)照。各組小鼠均于末次激發(fā)后24 h處死,取組織進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.3ELISA法測(cè)定血清TNF-α的含量末次霧化激發(fā)24 h后,麻醉小鼠,摘眼球取血約 500 μ l,2 000 rpm離心約2-3 min,取上清凍存于-70℃。收集齊后按照ELISA檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū),測(cè)定TNF-α含量。

1.4RT-PCR法檢測(cè)肺組織中TNF-αmRNA的表達(dá)

1.4.1肺組織總RNA的提取:依據(jù)Trizol法總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.2引物合成:TNF-α及內(nèi)參照GAPDH引物均由上海生工生物工程公司合成。TNF-α上游引物:5′-ATGAGCACAGAAAGCATGATCC-3′,下游引物:5′-TCACAGAGCAATGACTCCAAAG-3′,擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 長(zhǎng) 度 708 bp;GAPDH上游引物:5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGT ATGT-3′,下游引物:5′-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度616 bp。

1.4.3RT-PCR:用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系為10 μ l。用PCR擴(kuò)增系統(tǒng)擴(kuò)增,反應(yīng)體系為40 μ l,94℃預(yù)變性2 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán),再72℃延伸7 min保護(hù)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,用凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定各擴(kuò)增條帶的吸光度(OD)值,將目的條帶與內(nèi)參帶的比值作為其mRNA水平的指標(biāo)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理,組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn),P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 ELISA法對(duì)血清TNF-α含量的測(cè)定

哮喘組、NGF阻斷組血清TNF-α的水平明顯高于正常對(duì)照組血清TNF-α的水平(P＜0.05),差異具有顯著性;NGF阻斷組血清TNF-α的水平低于哮喘組血清TNF-α的水平(P＜0.05),差異具有顯著性。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 RT-PCR法檢測(cè)肺組織TNF-αmRNA的表達(dá)

TNF-α、GAPDH cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為708 bp、616 bp,與預(yù)計(jì)值相符(圖1)。電泳后,將凝膠在圖像處理系統(tǒng)上分析,得出二者的OD值。利用GAPDH cDNA的OD值作為參照,求出各組小鼠TNF-α mRNA表達(dá)的相對(duì)值,單位:%。哮喘組較正常對(duì)照組TNF-αmRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05),NGF阻斷組較哮喘組顯著減弱(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 TNF-α的 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

表1 各組小鼠血清TNF-α含量和肺組織TNF-αmRNA的含量(s)

表1 各組小鼠血清TNF-α含量和肺組織TNF-αmRNA的含量(s)

注:*與正常對(duì)照組比較,P＜0.05;△與哮喘組比較,P＜0.05。

正常對(duì)照組 10 114.61±18.28 30.54±6.81哮喘組 10 196.83±46.05* 57.39±8.98*NGF阻斷組 10 136.27±24.68*△ 37.00±7.95*△

3 討論

早在三四十年代,人們就發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素能引起小鼠移植腫瘤的出血壞死。1975年,Carswell等人發(fā)現(xiàn)卡介苗攻擊小鼠后再用內(nèi)毒素處理,小鼠血清中出現(xiàn)一種能誘導(dǎo)腫瘤組織出血壞死的物質(zhì),故命名為腫瘤壞死因子(TNF)。根據(jù)來(lái)源和結(jié)構(gòu)的不同,可將TNF分為T(mén)NF-α和TNF-β兩型。TNF-α的生物學(xué)活性占TNF總活性的70%～95%,TNF-α主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌,其他類(lèi)型的細(xì)胞,如成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等在一定條件下也具有產(chǎn)生和釋放TNF-α的能力。TNF-α是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的前炎癥細(xì)胞因子,與機(jī)體的炎癥、免疫反應(yīng)有著十分密切的關(guān)系。適量的TNF-α對(duì)機(jī)體的保護(hù)反應(yīng)是必需的,但過(guò)量的TNF-α則對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷反應(yīng)[2]。TNF-α參與哮喘氣道炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制主要為:(1)增加血栓素的血管收縮活性,使肺血管壓力升高,滲出增多,增高肺毛細(xì)血管通透性;(2)趨化活性巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞,激活過(guò)氧化物陰離子的產(chǎn)生,誘導(dǎo)氧化爆發(fā)、細(xì)胞脫顆粒等活性作用,導(dǎo)致氣道炎癥;(3)刺激多種細(xì)胞表達(dá)IL-8,使中性粒細(xì)胞大量進(jìn)入呼吸道,產(chǎn)生高濃度細(xì)胞蛋白酶,使呼吸道腺體分泌增多致氣道阻塞;(4)誘導(dǎo)粘附分子、刺激多形核中性粒細(xì)胞粘附內(nèi)皮,使嗜中性粒細(xì)胞游出血管壁增多,發(fā)揮致炎作用;(5)通過(guò)核轉(zhuǎn)移因子AP-1促進(jìn)與炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子受體的基因表達(dá)[3]。Silvestri M等[4]報(bào)道哮喘發(fā)作期患者TNF-α水平明顯高于緩解期及對(duì)照組,而且哮喘病情越嚴(yán)重,持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng),其血清TNF-α濃度越高,反之病情越輕,持續(xù)時(shí)間越短濃度越低。在我們的實(shí)驗(yàn)中,ELISA法測(cè)定了哮喘小鼠血清TNF-α水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠肺組織血清TNF-α水平均較正常對(duì)照組明顯增高,說(shuō)明TNF-α參與了哮喘的發(fā)生。進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR法測(cè)定了肺組織TNF-αmRNA的表達(dá),結(jié)果顯示,哮喘小鼠肺組織TNF-αmRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組增高,說(shuō)明哮喘小鼠血清TNF-α水平升高可能系由肺組織TNF-α mRNA表達(dá)增加,TNF-α生成增多,釋放入血所致。由此可知,TNF-α與哮喘有著密切的關(guān)系,參與哮喘的病理生理過(guò)程。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)是對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化、存活期延長(zhǎng)具有促進(jìn)作用的一類(lèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員之一。NGF是一種多功能的細(xì)胞生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)因子,除對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用外,尚對(duì)免疫[5]、生殖[6]、細(xì)胞增殖[7]、造血[8]等具有廣泛的作用。NGF參與免疫炎癥調(diào)控以及復(fù)雜的神經(jīng)-免疫相互作用機(jī)制,可認(rèn)為是神經(jīng)可塑性和免疫可塑性的雙重調(diào)控介質(zhì)。支氣管哮喘是一種由多種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞組分及神經(jīng)遞質(zhì)參與的氣道慢性非特異性炎癥。眾多實(shí)驗(yàn)已證實(shí),NGF在哮喘發(fā)病中具有重要的病理生理意義,包括可促成哮喘氣道炎癥、高反應(yīng)性及氣道重塑[9]。

那么,NGF對(duì)TNF-α有何影響呢?有人[10]應(yīng)用原位雜交方法結(jié)合顯微圖像分析,研究實(shí)驗(yàn)性哮喘豚鼠下呼吸道和內(nèi)臟感覺(jué)傳入部位TNF-αmRNA表達(dá)的變化以及NGF抗體對(duì)其的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)哮喘豚鼠TNF-α mRNA的表達(dá)在氣道上皮、肺內(nèi)炎性細(xì)胞、C7-T5段脊神經(jīng)節(jié)及脊髓后角內(nèi)均明顯上調(diào);在哮喘+NGF抗體組,上述部位內(nèi)TNF-αmRNA的表達(dá)明顯低于哮喘組。我們的實(shí)驗(yàn)在測(cè)定哮喘小鼠肺組織TNF-αmRNA的表達(dá)及血清TNF-α水平的基礎(chǔ)上,觀察了拮抗NGF作用后哮喘小鼠TNF-α表達(dá)的變化。我們發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠肺組織TNF-αmRNA的表達(dá)及血清TNF-α水平均較正常對(duì)照組增高,而應(yīng)用了抗NGF抗體拮抗了NGF作用后TNF-α表達(dá)水平下降。由此,我們判斷NGF可能通過(guò)增進(jìn)肺組織TNF-αmRNA的表達(dá)作為參與哮喘的發(fā)病機(jī)制之一。

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