劉 然,王 蘋,范東艷,范洪學,郭 麗*

(1.吉林大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學教研室,吉林長春130021;2.長春市中心血站;

3.吉林大學第一醫(yī)院;4.西藏大學醫(yī)學院)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種發(fā)病率極高且較難治愈的疾病。因為SCI最終導致癱瘓,所以不僅給患者本人及家庭帶來嚴重的經(jīng)濟負擔也帶來了巨大的社會問題[1,2]。如何在SCI后維持脊髓神經(jīng)元存活和軸突的再生能力,延緩其變性壞死是目前神經(jīng)科學和臨床科醫(yī)學迫切需要解決的難點和熱點問題。神經(jīng)營養(yǎng)因子 (neurotrophic factors,NTFs)是一類調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、成熟、維持神經(jīng)功能的天然蛋白質(zhì)。神經(jīng)營養(yǎng)因子是神經(jīng)元存活和發(fā)揮功能的基礎(chǔ),具有影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟,調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞,影響神經(jīng)損傷的病理反應(yīng),促進神經(jīng)元修復(fù)和再生等功能,所以神經(jīng)營養(yǎng)因子是保護神經(jīng)元和促進其修復(fù)再生的必需因子。文獻報道,SCI后腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)和NT3的表達上調(diào)可以促進脊髓神經(jīng)元、軸突和髓鞘的再生修復(fù)[3,4]。本實驗通過觀察BDNF和NT3在體外脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)中的作用,比較它們對脊髓神經(jīng)元生長發(fā)育作用的影響,為臨床上應(yīng)用NTFs治療脊髓損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物與器材動物:Wistar大鼠購自吉林大學醫(yī)學院動物中心。細胞培養(yǎng)試劑:DMEM/F12和胎牛血清購自Gibco公司。胰蛋白酶購自Gibco公司。兔抗鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶 (neur onals pecific enolase,NSE)和Alexa Fluor 555標記的山羊抗小鼠IgG的二抗購于Molecular Probes公司,倒置相差顯微鏡Olympus公司。激光掃描共聚焦顯微鏡Olympus公司。Ad-BNNF和Ad-NT3為本實驗室采用pAdeasy系統(tǒng)構(gòu)建的,BDNF或NT3基因插入pAd-ShuttleCMV,然后與缺乏E1和E3區(qū)序列的腺病毒大質(zhì)粒pAdeasy-1,在E Coli BJ5183細胞中進行同源重組,293細胞內(nèi)包裝病毒。重組腺病毒滴度為2×108VP/ml。

1.2脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元分離參考文獻[5]的方法進行分離。取新生24 h Wistar大鼠,無菌條件下剝離背部皮膚及軟骨,暴露椎體外側(cè)隱窩中圓形脊神經(jīng)節(jié),逐個摘除,置于預(yù)冷PBS內(nèi),剝除神經(jīng)節(jié)表面筋膜,置于另一個盛有預(yù)冷PBS的平皿中,眼科剪將神經(jīng)節(jié)剪至0.5 mm3大小的碎塊,并用預(yù)冷PBS沖洗3遍,將組織塊移入盛有0.25%胰蛋白酶的離心管中,37℃培養(yǎng)箱中消化20 min,用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化,吸管輕柔吹打數(shù)次,濾掉組織塊,離心(1 000 rpm/min 10 min),棄上清,以10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基再次重懸,200目濾網(wǎng)過濾,計數(shù)細胞存活率為90%,調(diào)整細胞濃度為1×106/ml,接種于35 mm培養(yǎng)皿上。

1.3實驗分組細胞接種3 d后,分別加入重組腺病毒滴度為2×108VP/ml的Ad-BDNF和Ad-NT3,無血清轉(zhuǎn)染3 h,轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)15 d,以未加任何神經(jīng)營養(yǎng)因子為對照。同時將BDNF和NT3聯(lián)合應(yīng)用,并與單獨應(yīng)用組進行比較。

1.4免疫熒光染色免疫熒光染色在誘導的不同時間收獲樣本。棄去培養(yǎng)基,用Hank’s溶液洗滌2次,加入4%的多聚甲醛溶液,固定30 min。用PBS洗滌3×5 min,加入0.1%Triton X-100處理15 min,5%山羊血清封閉1 h,加入一抗(NSE,1∶100),室溫孵育1 h,用PBS洗滌3×15min,加入Alexa Fluor 555標記的山羊抗小鼠IgG的二抗(1∶400),室溫避光放置1 h,PBS洗滌3×15 min,輕輕搖動。棄掉洗滌液,最后樣品均再用1 g/ml的Hoechest33342復(fù)染細胞核,室溫溫育5 min。甘油封片后,用Fluview 1000激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。陰性對照實驗中,用PBS代替第一抗體來排除非特異性的二抗結(jié)合。共聚焦顯微鏡觀察PMT(電壓值)為650,C.A(針孔值)為100,采用單通道掃描,檢測波長分別為405 nm和563 nm。陽性計數(shù):×400熒光顯微鏡下,隨機選取6個區(qū)域用目鏡網(wǎng)格測同尺計算陽性細胞率(%),即陽性細胞數(shù)/網(wǎng)格范圍內(nèi)的細胞總數(shù),取平均值。

1.5統(tǒng)計學處理所有資料均采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。計量資料用(s)表示。

2 結(jié)果

2.1形態(tài)學觀察脊髓神經(jīng)元細胞倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)24 h后,可見大部分細胞已貼壁且呈現(xiàn)均勻分布,胞體呈圓形或橢圓形,可見細胞突起。隨培養(yǎng)時間延長,神經(jīng)元細胞突起增多形成網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)的第9 d后鏡下可見,細胞數(shù)減少出現(xiàn)死亡細胞。神經(jīng)元在普通培養(yǎng)基中可維持存活20 d左右。

2.2神經(jīng)元細胞免疫熒光染色本實驗采用免疫熒光技術(shù)檢測原代培養(yǎng)的脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元含量,結(jié)果顯示NSE陽性細胞,染色呈紅色熒光。正常培養(yǎng)6 d的脊髓神經(jīng)元細胞中NSE陽性神經(jīng)元占40%左右(見圖1)。

圖1 正常培養(yǎng)6 d的脊髓神經(jīng)元細胞NSE免疫熒光染色(×400)

2.3神經(jīng)營養(yǎng)因子對脊髓神經(jīng)元存活的影響在BDNF和NT3轉(zhuǎn)染后,持續(xù)培養(yǎng)到第15 d,計數(shù)神經(jīng)元的存活率。結(jié)果顯示,單純細胞培養(yǎng)組神經(jīng)元僅有(25±2.18)%的存活;BDNF組神經(jīng)元的存活率為(50±3.42)%;NT3組神經(jīng)元的存活率為(42±3.12)%;BDNF+NT3組神經(jīng)元存活率為(63±2.53)%。脊髓神經(jīng)元存活率聯(lián)合應(yīng)用與單獨應(yīng)用相比有顯著性差異(P＜0.05)。

2.4NTFs轉(zhuǎn)染后不同時間脊髓神經(jīng)元存活的變化在BDNF和NT3轉(zhuǎn)染后,持續(xù)培養(yǎng)的同時間點,觀察NSE陽性細胞數(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在持續(xù)培養(yǎng)8 d時,NTs轉(zhuǎn)染組的NSE陽性細胞比6 d時間點略高。8 d后神經(jīng)元死亡明顯減慢,而單純培養(yǎng)組的神經(jīng)元存活呈線性下降(見圖2)。

3 討論

神經(jīng)營養(yǎng)因子是維持神經(jīng)元存活、分化和發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。在體內(nèi)脊髓神經(jīng)元的存活不僅需要從血液中攝取營養(yǎng)物質(zhì),而且需要多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的支持,這些因子可來自神經(jīng)細胞本身,也可來自外周細胞。當神經(jīng)元受損處于凋亡前狀態(tài),若給予積極的干預(yù)措施,有望逆轉(zhuǎn)或減緩神經(jīng)元的變性壞死。文獻報道,BDNF能夠促進損傷后軸突的存活,還能促進神經(jīng)元功能恢復(fù)[6,7]。Johnson等最近報道了NT3結(jié)合PDGF能夠促進神經(jīng)前體細胞在脊髓損傷部位分化為神經(jīng)元。Zhang等應(yīng)用NT3修飾神經(jīng)干細胞移植治療小鼠脊髓損傷模型,發(fā)現(xiàn)移植30天后,脊髓功能明顯改善,損傷部位轉(zhuǎn)染陽性細胞增加[8,9]。腺病毒載體作為一種高效的基因轉(zhuǎn)移載體被廣泛應(yīng)用于外源基因轉(zhuǎn)導哺乳動物細胞。原因是腺病毒基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,可插入大片段的外源基因,不發(fā)生基因重排,對宿主細胞要求不嚴,可感染分裂期細胞,也可感染靜止期的細胞。另外腺病毒基因組不與宿主基因組發(fā)生整合,安全可靠,是基因治療的理想載體。本實驗采用重組腺病毒介導NT3和BDNF基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元,比較了神經(jīng)營養(yǎng)因子對體外培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元存活影響,發(fā)現(xiàn)BDNF和NT3均對脊髓神經(jīng)元有一定的保護作用。并且兩種營養(yǎng)因子聯(lián)合轉(zhuǎn)染作用更強,表明兩種因子對脊髓神經(jīng)元的存活有疊加效應(yīng),推測它們可能是通過不同的神經(jīng)生長調(diào)節(jié)途徑發(fā)揮作用。觀察BDNF組、NT3組和BDNF+NT3組作用后不同時間點脊髓神經(jīng)元的存活率,發(fā)現(xiàn)單純培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)對照組隨培養(yǎng)時間延長細胞數(shù)目明顯減少。而添加NTFs組的脊髓神經(jīng)元的存活率在8 d時略高于前一時間點。推測這可能是由于BDNF、NT3不僅對脊髓神經(jīng)元具有營養(yǎng)、支持、保護的作用,而且還可能促進了神經(jīng)前體細胞向神經(jīng)元分化。實驗中分離提取的神經(jīng)元取材于椎體外側(cè)隱窩中的脊神經(jīng)節(jié),這個區(qū)域除了含有大量的脊髓神經(jīng)元外還有許多神經(jīng)前體細胞,這些前體細胞具有分化潛能,在 BDNF和NT3的作用下,可能分化成脊髓神經(jīng)元。Bonner等的實驗結(jié)果也證實了這個推測[10]。

圖2 NTFs轉(zhuǎn)染后不同時間脊髓神經(jīng)元存活的變化

本實驗分離培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元24 h后,可見大部分細胞貼壁呈現(xiàn)均勻分布,細胞突起明顯。隨培養(yǎng)時間延長,神經(jīng)元細胞突起增多形成網(wǎng)絡(luò)。分別在培養(yǎng)的不同時間檢測NSE陽性細胞率,結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元存活率隨培養(yǎng)時間延長下降,但NTFs作用的脊髓神經(jīng)元存活率明顯高于對照組(P＜0.05),而且BDNF+NT3作用組的神經(jīng)元存活率與各實驗組相比存活率最高。

脊髓損傷修復(fù)的機制雖然還不清楚,但目前的大量研究已經(jīng)證實神經(jīng)營養(yǎng)因子在脊髓損傷后的修復(fù)起到了關(guān)鍵性的作用。雖然各種因子由于其自身的特異性,使其發(fā)揮效應(yīng)的途徑不盡相同,但總的來說神經(jīng)營養(yǎng)因子在脊髓損傷后的修復(fù)是不可缺少的。隨著研究的不斷深入和對神經(jīng)營養(yǎng)因子認識的不斷加深,脊髓損傷的治療將會取得更大的發(fā)展。

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