張繼紅,溫春陽,于曉艷,李相軍,尹 麗,任立群*

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130021;2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院;3.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)部)

近些年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及對(duì)大腸癌的機(jī)制研究的不斷深入,如何針對(duì)基因的靶向治療已成為熱點(diǎn)。Ang-1作為血管生成素(Ang)家族的一種,據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道,主要是通過Ang-1/Tie-2信號(hào)系統(tǒng)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生存,起到抗凋亡的作用,但是對(duì)于此通路Tie-2后途徑仍不清楚,據(jù)Kim[1]等研究推測(cè),其抗凋亡的機(jī)理可能與PI3’-kinase/Akt調(diào)節(jié)的通路有關(guān)。我們應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)其對(duì)HCT-8細(xì)胞中的Tie-2、PI3K以及Akt三種蛋白的激活情況,并加入PI3’-kinase的抑制劑LY294002進(jìn)一步檢測(cè)三種蛋白的表達(dá),旨在發(fā)現(xiàn)Ang-1對(duì)HCT-8細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制,為大腸癌的分子靶向治療提供一些參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8(北京藥物研究所),DMEM培養(yǎng)基(Gibco),Ang-1(Pepretech),Western blotting檢測(cè)試劑盒、LY294002、GAPDH多克隆抗體(Santa Cruz),Tie-2多克隆抗體、PI3K多克隆抗體、Akt多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司),即用型SP免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物工程公司),蛋白質(zhì)marker(Solarbio),其余均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.2 細(xì)胞分組

1.2.1正常對(duì)照組(C組)用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞凋亡組(0組)用無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.3血管生成素-1組(Ang-1組):在0組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上加入Ang-1(根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定后續(xù)實(shí)驗(yàn)Ang-1的濃度為0.2 mg/L)。

1.2.4LY294002組(阻斷劑LY294002+Ang-1組):在Ang-1組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上加入阻斷劑LY294002。

1.3 MTT法檢測(cè)條件培養(yǎng)基中細(xì)胞增殖情況

不同濃度的細(xì)胞消化后接種至6孔板。血清的培養(yǎng)基同步24 h后加入條件培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,組織細(xì)胞裂解液反復(fù)吹打,裂解后,加凝膠上樣緩沖液,加熱、離心,稀釋后,于260 nm及 280 nm處測(cè)定吸光度值(A)。電泳,轉(zhuǎn)膜后封閉PVDF膜,分別加入一抗、二抗,觀察相應(yīng)蛋白條帶表達(dá)情況,用凝膠成像及分析系統(tǒng)分析蛋白顯色的密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1MTT法檢測(cè)不同濃度的Ang-1蛋白對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8生長(zhǎng)的影響蛋白在濃度為0.05 mg/L時(shí)對(duì)結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞株即有抗凋亡作用,且隨著濃度的增加抗凋亡作用平穩(wěn),根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定后續(xù)實(shí)驗(yàn)Ang-1的濃度為0.2 mg/L(圖1)。

圖1 不同濃度的Ang-1對(duì)HCT-8細(xì)胞增殖的影響

2.2應(yīng)用Western blotting蛋白免疫印跡法檢測(cè)三種蛋白的表達(dá)見表1,圖2、3。

表1 Ang-1對(duì)HCT-8細(xì)胞的抗凋亡作用

圖2 HCT-8細(xì)胞中 Ang-1對(duì) Tie-2、PI3K、Akt的激活及應(yīng)用LY294002抑制劑后三者的表達(dá)

圖3 a:0組與C組相比,P＜0.01;b:Ang-1組與0組相比,P＜0.01;c:Ang-1+阻斷劑(LY294002組)與Ang-1組相比,P＜0.01

3 討論

促血管生成素家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性的促血管生成因子(endothelium-specific proangiogenic factor)家族[2]。包括4種:Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4,它們均屬于酪氨酸激酶受體Tie-2的配基。Ang-1作為該家族中的重要一員,通過旁分泌的形式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞[3],主要表達(dá)于血管周圍細(xì)胞和壁細(xì)胞,是Tie-2最主要的激動(dòng)劑,在血管新生及維持血管完整和穩(wěn)定中起重要作用[4]。Stoeltzing等[5]應(yīng)用重組Ang-1轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29以評(píng)價(jià)Ang-1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和血管形成的影響,結(jié)果提示,對(duì)于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的病人,Ang-1可能起到抗腫瘤性藥物或抗血管滲透性藥物的作用。因此Ang-1作為抗腫瘤和抗血管通透性因子作用于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌,有影響血管發(fā)生和血管通透性來阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能。然而Ang-1在不同腫瘤中其表達(dá)并不一致,如在膀胱癌的血清中Ang-1明顯高于非腫瘤組織和正常對(duì)照[6]。Tanaka等[7]研究發(fā)現(xiàn):Ang-1在肝癌和正常肝組織中的表達(dá)無顯著性差異。Alan[7]等研究發(fā)現(xiàn)Ang-1在胰腺腫瘤和正常胰腺組織中的表達(dá)無顯著性差異。Tait[9]分析了56個(gè)公開發(fā)表的關(guān)于腫瘤組織中Ang表達(dá)情況的研究資料并發(fā)現(xiàn),其中只有一半顯示腫瘤組織中Ang-1表達(dá)有所上調(diào)。本研究中,無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的HCT-8細(xì)胞中加入較少濃度(0.05 mg/L)即出現(xiàn)細(xì)胞增殖,結(jié)果提示,外源性Ang-1促進(jìn)HCT-8細(xì)胞的增殖,即具有抗凋亡作用,同時(shí)應(yīng)用Western blotting蛋白免疫印跡法測(cè)定Tie-2抗體的表達(dá)降低,因此Ang-1對(duì)HCT-8細(xì)胞的抗凋亡作用可能是通過Ang-1/Tie-2途徑實(shí)現(xiàn)的。

國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)Tie-2的受體后途徑還不清楚,Murakami T[10]等研究發(fā)現(xiàn)Ang-1通過P13K/AKT通路抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。Harfouche等研究發(fā)現(xiàn),Ang-1可以通過抑制3磷酸激酶活性,抑制線粒體酶釋放,上調(diào)生存蛋白等多個(gè)途徑抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,而該作用也是通過Tie-2介導(dǎo)的[11]。Kim I等認(rèn)為,Ang-1是由血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍的支持細(xì)胞合成,通過旁分泌作用,與附近血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的Tie-2受體特異性結(jié)合并使其磷酸化,通過磷脂酰肌醇3激酶(P13K)、蛋白激酶B(Akt)、粘著斑激酶(FAE)等信號(hào)途徑[8,12,13],調(diào)節(jié)內(nèi)皮之間、內(nèi)皮-基質(zhì)之間相互作用,促進(jìn)血管成熟、穩(wěn)定。本研究中,加入Ang-1蛋白,三種抗體Tie-2、PI3K、Akt的表達(dá)降低,結(jié)果提示,外源性Ang-1對(duì)HCT-8細(xì)胞的抗凋亡作用的實(shí)現(xiàn)可能是通過Tie-2/PI3K/Akt信號(hào)途徑。

LY294002是 PI3K特異性阻滯劑,它可抑制PI3K而阻滯Akt的活性,從而阻滯了PI3K/Akt通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),使P-gp不能磷酸化活化,不能發(fā)揮其藥物泵作用,從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[14],逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥。本研究中應(yīng)用LY294002可以有效的降低Tie-2、PI3K和Akt的表達(dá),更能進(jìn)一步說明Ang-1對(duì)HCT-8的正調(diào)控效應(yīng),同時(shí)我們看到對(duì)Ang-1/Tie/Akt途徑的阻斷,可以有效地抑制HCT-8細(xì)胞的生長(zhǎng),達(dá)到治療腫瘤的作用,從而為大腸癌的靶向治療提供一些依據(jù)。當(dāng)然由于LY294002不溶于水,具有細(xì)胞毒性,現(xiàn)在僅限于體外研究,臨床應(yīng)用受限,因此,在以后的研究中,可采用該途徑的其他抑制劑如Akt抑制劑哌立福新(perifosine)等做進(jìn)一步探討。

[1]Kim I,Kim JH,Moon SO,et al.Angiopoietin-2 at high concentration can enhance endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3’-kinase/Akt signal transduction pathway[J].Oncogene,2000,19:4549.

[2]杜 彬,周序瓏.血管生成素的特點(diǎn)及其對(duì)血管新生的調(diào)節(jié)作用[J].中國(guó)病理生理雜志.2003,19(2):275.

[3]Fiedler U,Scharpfenecker M,Koidl S,et al.The Tie-2 ligand angiopoietin-2 isstored in and rapidly released upon stimulation from endothelial cellWeibel-Palade bodies[J].Blood,2004,103(11):4150.

[4]Zoya G,Belly K,Meir P,et al.Endothelial cells areactivated by angiopoeitin-1 gene transfer and producecoordinated sprouting in vitro and arteriogenesisin vivo[J].Biochemical and Biophysical Research Communica-tions,2007,359(2):263.

[5]Stoeltzing O,Ahmad SA,Liu W,et al.Angiopoietin-1 inhibits vascular permeability,angiogenesis,and growth of hepatic colon cancer tumors[J].CancerRes,2003,63:3370.

[6]Szarvas T,JgerT,Droste F,el al.Serum Levels of Angiogenie Factors and their Prognostic Relevance in Bladder cancer[J].Pathol Oncol Res,2008,20[Epnh ahead ofprint].

[7]Tanaka S,Mori M,Sakamoto Y,et al.Biologic significance of angiopoietin-2 expression in human hepatocellular carcinoma[J].J Clin Invest,1999,103:341.

[8]Kim I,Kim HG,Moon SO,et al.Angiopoiain-1 induces endothelial cell sprouting through the activation of focal adhesion kinase and plasmin secretion[J].Circ Res,2000,86:952.

[9]Tait C R,Jones P F.Angiopoietins in tumours:the angiogenic switch[J].J Pathol,2004,204(1):1.

[10]Murakami T,Takagi H,Suzuma K,et al.Angiopoietin-1 attenuates H2o2-induced SEKI/JNK phosphorylation through the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in vascular endothelial cells[J].J Biol Chem,2005,280(36):31841.

[11]Lafeur MA,Forsyth PFA,Atkinson SJ,et al.Perivascular cells regulate endothelial membrane type-matrix metal loproteinase activity[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,282:463.

[12]Kim I,Kim HG,So JN,et al.Angiopoietin-1 induces endothelial cell survival through the phosphatidylinositol-3,kinase/Akt signal transduction pathway[J].Circ Res,2000,86:24.

[13]Harfouche R,Hassessian HM,Guo Y,et al.Mechanisms which mediate the antiapoptotic effects of angiopoietin-1 on endothelial cells Microvasc Res,2002,64:135.

[14]夏 曙,于世英.抑制 PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提高化療效果的實(shí)驗(yàn)研究[J].腫瘤,2006,26(4):311.