韓海玲,孫玉芹,2*,宋文剛,朱玉紅,呂冬燕,朱艷彬,何海濤,姜 欣

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院心腦科,吉林吉林市132011;2.吉林大學(xué);3.吉林市水務(wù)集團(tuán)職工醫(yī)院)

血管內(nèi)皮細(xì)胞為襯覆于血管內(nèi)腔面的單層扁平細(xì)胞,依靠其正常的增殖和凋亡平衡,保證了血管的結(jié)構(gòu)和功能正常[1]。近年研究表明,越來越多的心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展與內(nèi)皮細(xì)胞增生及凋亡有關(guān)[2-4]。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)術(shù)后再狹窄作為目前冠心病介入研究領(lǐng)域的研究熱點。在目前的研究中,對血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究少見。本課題以LPC作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞建立再狹窄的內(nèi)皮細(xì)胞模型[4],并探討紅花黃色素對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的干預(yù)作用,以期為為臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO,美國),胎牛血清(杭州四季青公司),紅花黃色素、LPC、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(Sigma,美國),Annexin VFITCPPI凋亡檢測試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司),酶聯(lián)免疫檢測儀(Biotek,美國),熒光顯微鏡(Olymypus,日本),流式細(xì)胞儀(BD,美國),低溫離心機(jī)(Beckman,美國),NO測試盒(南京建成生物工程公司),高速低溫離心機(jī)(Eppendorf,美國)。

細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng):人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)株CRL-1730由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院饋贈。采用常規(guī)培養(yǎng),將凍存的HUVECs株解凍復(fù)蘇后,含15%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液,于37℃、100%飽和濕度、5%CO2孵箱培養(yǎng)。常規(guī)傳代,待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后用于實驗。

設(shè)計分組:取對數(shù)生長期細(xì)胞,按傳代方法制成單細(xì)胞懸液,進(jìn)行如下分組:(1)正常對照組當(dāng)細(xì)胞長至60%-70%滿時換培養(yǎng)液。(2)LPC組當(dāng)細(xì)胞長至60%-70%滿時換含有濃度為10 mg/L的LPC的PBS培養(yǎng)液。(3)低濃度HYSA組(LPC+HYSA2)當(dāng)細(xì)胞長至60%-70%并加入濃度為50 mg/L的HYSA孵育8 h后,再加入LPC(終末濃度10 mg/L),進(jìn)行相應(yīng)檢測。(4)高濃度HYSA(LPC+HYSA1)組HYSA濃度為100 mg/L,余同低濃度HYSA組。

1.2MTT實驗消化對數(shù)生長期的細(xì)胞,制成2×105細(xì)胞/ml細(xì)胞懸液,接種于96孔平板,每孔2×105細(xì)胞懸液100 μ l,同時分別加入上述終濃度藥物和RPMI1640培養(yǎng)液。培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h,采用MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖率。

1.3電鏡檢測細(xì)胞傳代培養(yǎng),分別加入LPC和上述藥物濃度的RPMI1640培養(yǎng)液,3 d后倒置鏡拍片后,消化并收集細(xì)胞,用 Epon 812包埋,切片,隨機(jī)拍攝電鏡照片,觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.4流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期變化消化C6,以5×105,接種25 cm2培養(yǎng)瓶,24 h后更換培養(yǎng)液,分別加入上述終濃度的藥物和RPMI1640培養(yǎng)液,此日被稱為第0天。在第3天分別收集各組細(xì)胞,以去除細(xì)胞碎片,加入0.5 ml冰冷的70%乙醇中,-20℃冰箱保存。將制備好的單細(xì)胞懸液固定液棄去(1 000 r/min,10min),冷PBS漂洗2次(1 000 r/min,5 min),調(diào)整細(xì)胞為1×109L-1,加入PI染液1.0 ml,避光染色30 min,上機(jī)分析,資料由ModFit軟件收集、貯存和分析。檢測各組的凋亡和細(xì)胞周期變化。見表1。

1.5NO測定(用Griess法測定)將HUVECs接種于6孔板上,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。24 h后按實驗分組進(jìn)行干預(yù)后,每組6個復(fù)孔,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h后,采用硝酸還原酶法測定NO含量,按試劑盒說明書操作。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1HYSA能夠逆轉(zhuǎn)LPC對HUVECs細(xì)胞增殖具有抑制作用且隨劑量的增加和作用時間的延長,作用效果增加明顯。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理,有顯著性差異(P＜0.05)見圖1。

圖1 不同劑量不同作用時間紅花黃色素對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

2.2電鏡檢測細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)變化電鏡下可見LPC作用后細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變,細(xì)胞體積變小(約為原細(xì)胞體積的70%)、變圓:細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)離散,開始向核膜下集中;細(xì)胞表面微絨毛變細(xì),細(xì)胞體及細(xì)胞核進(jìn)一步縮小,核內(nèi)染色質(zhì)呈顆粒狀或塊狀凝集于核膜下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和粒體膜碎裂呈空泡狀;微絨毛脫落、減少,核膜在核膜孔處斷裂,將染色質(zhì)分割成若干個核碎片;胞質(zhì)內(nèi)空泡增多。而對照組細(xì)胞體積大,胞質(zhì)少,核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻;細(xì)胞表面有大量的微絨毛。用LPC誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可行,見圖2a,b。

圖2 a 對照組

圖2 b 經(jīng)LPC作用24 h

2.3應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)檢測經(jīng)LPC作用于HUVECs細(xì)胞后,與對照組相比凋亡比率有明顯提高,同時細(xì)胞經(jīng)HYSA作用后細(xì)胞細(xì)胞凋亡明顯降低并且隨濃度的增大,凋亡率降低,LPC可以誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡,而HYSA可降低LPC作用后HUVECs細(xì)胞凋亡比率,較對照組,均有明顯降低(P＜0.05)。見表1。

表1 流式細(xì)胞檢測不同處理組細(xì)胞凋亡比率

2.4HSYA對NO水平的影響由表2結(jié)果可見,加藥孵育48 h時,HYSA組細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO水平比對照組顯著增高(P＜0.01);但LPC組仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照組(P＜0.01)。

表2 HSYA對HUVECs培養(yǎng)液中NO水平的影響(s,n=6)

表2 HSYA對HUVECs培養(yǎng)液中NO水平的影響(s,n=6)

與對照組及LPC組比較 *P＜0.01

組別 濃度/(mmol·L-1)NO/(umo l·L-1)對照 - 47.46±3.28 LPC 10 mg/L 30.65±4.63 HSYA1 50 mg/L 190.12±9.83*HSYA2 100 mg/L 70.75±6.46*

3 討論

經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)是目前治療心肌缺血安全、有效和常用的方法,但經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)后 3-6個月內(nèi)再狹窄發(fā)生率達(dá) 30%-50%,金屬內(nèi)支架的應(yīng)用降低了PTA術(shù)后急性閉塞的發(fā)生率,但并未能徹底解決再狹窄的問題。嚴(yán)重影響了PTCA的遠(yuǎn)期療效。支架部位的再狹窄更加難以處理等不利因素。大量實驗研究及臨床觀察表明再狹窄與血栓形成、內(nèi)膜增厚和血管重構(gòu)有關(guān),內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、修復(fù)及功能改變在其中扮演重要角色。一方面血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖;內(nèi)皮損傷導(dǎo)致其本身功能障礙,釋放NO等活性物質(zhì)減少,進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙及VSMC增殖增強(qiáng);另一方面另外內(nèi)皮細(xì)胞損傷及損傷后增殖減弱、凋亡增強(qiáng),使其對血管內(nèi)皮覆蓋的完整性遭到破壞,有利于VSMC過度增生及遷移至內(nèi)膜等,從而導(dǎo)致再狹窄的發(fā)生等[1,5-7]。

LPC是磷脂酶A2水解磷脂酰膽堿的產(chǎn)物之一,可由人體內(nèi)低密度脂蛋白膽固醇氧化過程中經(jīng)磷脂酶A2催化產(chǎn)生,具有脂的第二信使功能,能夠激發(fā)細(xì)胞的多種反應(yīng)[8]。LPC是ox-LDL的主要活性成分,在AS發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[9]。

本課題以LPC孵育HUVECs制造PCI術(shù)后再狹窄的內(nèi)皮細(xì)胞模型基于以下考慮:內(nèi)皮細(xì)胞損傷是PCI術(shù)后再狹窄的生物性因素之一,在再狹窄的形成中ox-LDL是內(nèi)皮細(xì)胞損傷的因素之一[9],ox-LDL作用于內(nèi)皮細(xì)胞膜,引起一系列過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng),并產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物。這些脂質(zhì)過氧化物不僅直接損傷細(xì)胞的DNA,還誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。而LPC是ox-LDL的主要活性成分,在ox-LDL致病過程中起重要作用。有研究顯示,ox-LDL可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞NO生成減少[10]。NO具有舒張血管、抑制平滑肌細(xì)胞增殖和血小板聚集、減少白細(xì)胞黏附、減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用[8,9]。本研究以溶血卵磷脂孵育HUVECs后,HUVECs增殖減弱,具有凋亡誘導(dǎo)其凋亡率增加,NO合成減少,和ox-LDL引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷是一致的,亦和動物實驗的內(nèi)皮細(xì)胞損傷是一致的[10],因此LPC誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可作為PCI術(shù)后再狹窄的內(nèi)皮細(xì)胞模型。

近年的大量研究顯示,中藥提取物在保護(hù)血管內(nèi)皮功能、防治PCI術(shù)后再狹窄中起重要作用。但對紅花黃色素的研究較少。最近的一些研究顯示紅花黃色素除改善血脂異常外,尚可抑制血小板黏附聚集、預(yù)防和延緩動脈粥樣硬化進(jìn)程、降低心血管急性事件的發(fā)生率[11]。本研究顯示HYSA可改善LPC誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。HYSA干預(yù)后,內(nèi)皮細(xì)胞增殖增強(qiáng),凋亡減弱,NO合成增加,且紅花黃色素的對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用呈時間效應(yīng)、濃度效應(yīng)依賴關(guān)系,與報道的研究[12]結(jié)果一致。紅花黃色素的這些作用有利于保護(hù)PCI術(shù)損傷的血管內(nèi)皮,避免金屬支架與血液的直接接觸,減少不良刺激;HYSA促進(jìn)NO等活性物質(zhì)分泌,從而舒張血管,抑制平滑肌細(xì)胞增殖和血小板聚集,減少白細(xì)胞黏附,有效防止血栓形成,因此紅花黃色素能夠起到防治PCI術(shù)后再狹窄的作用。總之,HYSA可改善LPC導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞增強(qiáng)及凋亡變化,增加血管內(nèi)皮細(xì)胞NO濃度,加速內(nèi)皮損傷后的內(nèi)皮化,為紅花黃色素防治PCI術(shù)后再狹窄提供了理論基礎(chǔ)。當(dāng)然,HYSA對HUVECs細(xì)胞的保護(hù)作用的機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。

[1]DiazMN,Frei B,V ita JA,et al.Antioxidants and atherosclerotic heart disease[J].N Eng1 J Med,1997,337(6):408.

[2]MatsumotoT,Kobayash IT,KamataK.Role of Lysophosphatidylcholine(lpc)in atherosclerosis[J].CurrM ed Chem,2007,14(30):309.

[3]Kockx MM,Knaapen MW.The role of apoptosis in vascular disease[J].J Pathol,2000,190(3):267.

[4]Werner N,N icken ig G.Influence of cardiovascular risk factors on endothelial progenitor cells:limitations for therapy[J].Arter ioscler Thromb Vasc Biol,2006,26(2):257.

[5]徐志勇,張良安.經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)的現(xiàn)狀[J].國外醫(yī)學(xué).心血管疾病分冊,2003,30(3):147.

[6]Lowe HC,Oester le S N,Khachig ian L M.Coronary instentrestenosis:current status and future strategies[J].J Am Coll Cardiol,2002,39:183.

[7]Wiegman P J,Barry W L,McPherson J A,et al.All-trans-Retinoic Acid Limits Restenosis After Balloon Angioplasty in the Focally Atherosclerotic Rabbit:a favorable effect on vessel remodeling[J].Arterioscler Thormb Vasc Bil,2000,20(1):89.

[8]Asahara T,BautersC,Pastore C,et al.Local delivery of vascular endothelial growth factor accelerates reendothelializat ion and attenuat es intimal hyperplasis in ballon2injured rat carot id artery[J].Circulation,1995,91:2793.

[9]Van Hove C,Carreer Bruhwy ler F,Geczy J,et a.l.Long-term treatment with the NO-donormolsidomine reduces circulating ICAM-1 levels in patients with stable angina[J].Atherosclerosis,2005,180(2):399.

[10]張 嶺,宋 艷,李長齡,等.羥基紅花黃色素A對常氧/低氧犬胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響[J].中草藥,2008,39(1):930.

[11]ZhuHB,Wang ZH,Ma CJ,et al.Neuroprotective effects of hydroxysafflor yellow A:In vivo and in vitro studies[J].Planta Med,2003,69:429.