張 薇,姚 青,王明遠(yuǎn),蘇小軍,熊興耀

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,長(zhǎng)沙 410128;2湖南輕工業(yè)研究所,長(zhǎng)沙 410002;3湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410128)

水稻秸稈木質(zhì)纖維素經(jīng)輻照加酶處理轉(zhuǎn)化的糖組成很復(fù)雜,已知的成分由木糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、麥芽糖、纖維二糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等組成。其中糖的種類與含量是將其發(fā)酵成燃料乙醇的參考指標(biāo)[1～6]。目前,有關(guān)其糖的測(cè)定方法有很多,常用的方法有滴定法、旋光法、薄層法、液相色譜法、氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法、離子色譜法等[7～9]。本文比較了采用液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、離子色譜法分離測(cè)定木糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、麥芽糖、纖維二糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等組成的混合物。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

葡萄糖 (AR)、木糖 (GR)、果糖 (AR)、鼠李糖(GR)、半乳糖 (AR)、麥芽糖 (AR)、葡萄糖醛酸 (AR)、半乳糖醛酸(AR)、纖維二糖 (AR)、蔗糖 (AR)、乳糖(AR)等購(gòu)于天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司;纖維素酶購(gòu)于湖南鴻鷹祥生物工程公司;實(shí)驗(yàn)所用水都為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

離子色譜儀 ICS-3000,美國(guó)戴安公司;HP5890氣相色譜儀;Agilent HPLC1200液相色譜儀;Beckman P/AGETMMDQ(Beckman公司 )。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合糖溶液 A:精確稱取葡萄糖、果糖各 0.0450 g,蔗糖、麥芽糖各 0.0900 g于容量瓶中,用超純水定容至25 mL,即為 10 mmol/L混合工作對(duì)照糖溶液。

混合糖溶液 B:蔗糖、麥芽糖、乳糖各 0.0900 g,葡萄糖0.0450 g于容量瓶中,用超純水定容至25 mL,即為 10 mmol/L混合工作對(duì)照糖溶液。

緩沖液:精密稱取吲哚-3-乙酸 0.0175 g,磷酸鈉0.0950 g,加入適量超純水,緩慢滴加 1 mmol/L氫氧化鈉,同時(shí)攪拌控制 pH值在 11.0以下至吲哚-3-乙酸完全溶解,定容至 50 m L,4℃冰箱備用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、果糖、纖維二糖、麥芽糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸各 0.0500 g于容量瓶中,用超純水定容至 10 mL,搖勻,再取其中1.00 mL到10 mL容量瓶中,以超純水稀釋至刻度線,搖勻配成 5 mg/L的 9種混合糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2 氣相色譜法測(cè)定條件

儀器:SP6890氣相色譜儀。檢測(cè)器:FID。分析柱:Agilent HP-1 30 m×0.25 mm×0.25μ m。 載氣:N2:40 m L/min,H2:40 mL/min,Air:400 mL/min。柱溫:230℃,進(jìn)樣口溫度 280℃,檢測(cè)溫度 300℃。

2.3 高效液相色譜法測(cè)定條件

儀器:Agilent HPLC1200液相色譜儀。檢測(cè)器:ELSB-3300(蒸發(fā)光散色檢測(cè)器),要求流動(dòng)相不含不揮發(fā)鹽。色譜柱類型尺寸:ZORBAX Eclipse XPB-C18 4.6 mm×250 mm。流動(dòng)相:乙腈 /水63%/37%。柱溫:35℃。 氣體流速:1.5 L/min,檢測(cè)溫度 50℃。

2.4 毛細(xì)管電泳法測(cè)定條件

儀器:Beckman P/AGETMMDQ,二極管矩陣檢測(cè)器,Beckman System Gold軟件,320-pH計(jì)。

2.5 離子色譜法測(cè)定條件

戴安離子色譜儀 ICS-3000,安培檢測(cè)器。波形:糖四電位波形。色譜柱類型尺寸:CarboPac PA20分析柱,150 mm× 3 mm,CarboPac PA20保護(hù)柱,50 mm×3 mm。電極:Au電極,Ag-AgCl參比電極。淋洗液組成及流速:NaOH/NaOAc,梯度:0～15 min,NaOH 10 mM;25～ 33 min,NaOH 100 mM;35～ 50 min,NaOH 100 mM,NaOAc 120 mM;50.1～ 55 min,NaOH 200 mM;55.1～65 min,NaOH 10 mM 0.48 m L/min。柱溫:30℃。進(jìn)樣體積:25μ L。進(jìn)樣方式:自動(dòng)進(jìn)樣。

3 結(jié) 果

3.1 氣相色譜法結(jié)果

取0.2 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于20 mL的黑塞管中,加入2 mL硼氫化鈉 /二甲亞砜 (2 g/100 mL)溶液,放于40℃水浴90 min。取出加入0.2 mL冰醋酸終止反應(yīng),加入 2 mL醋酸酐,0.2 mL1-甲基吲哚反應(yīng) 10 min,加10 m L雙蒸水,然后加入 1 mL二氯甲烷,搖 1 min,靜置分層,取出二氯甲烷層,于-20℃冰箱中,待上氣相色譜分析。

結(jié)果表明,氣相色譜法是測(cè)單糖的較好方法,但二糖不好氣化不好測(cè)。

3.2 高效液相色譜法結(jié)果

取20 m L的標(biāo)準(zhǔn)溶液于20 mL的容量瓶中,過(guò)濾,進(jìn)樣20μL,在上述色譜條件下進(jìn)行 HPLC分析。

結(jié)果表明,高效液相色譜法定量上有優(yōu)勢(shì),進(jìn)樣量能控制,但分離效果不理想。

3.3 毛細(xì)管電泳法結(jié)果

在電壓 29 kV,毛細(xì)管內(nèi)徑 50μ m,樣品槽溫度25℃,毛細(xì)管溫度25℃,緩沖體系pH12.31條件下對(duì)混合糖溶液 A、混合糖溶液 B進(jìn)行分離。檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm。

由于在 pH12.31條件下混合糖 B不能完全分離,對(duì)pH條件進(jìn)行進(jìn)一步摸索。

以 1 mmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)緩沖液至 pH12.25,pH12.31,pH12.36,pH12.40,pH12.46,用 0.22 μ m的水膜過(guò)濾后對(duì)混合糖溶液 B進(jìn)行電泳分析。

緩沖液 pH12.31條件下,混合糖溶液 A分離圖譜如圖 1。緩沖液 pH12.31條件下,混合糖溶液B分離圖譜如圖 2。

在這一條件下雖然大部分糖類可較好分離但仍有部分重合現(xiàn)象,特別是麥芽糖和葡萄糖這兩個(gè)稻稈木質(zhì)纖維素水解液中常會(huì)出現(xiàn)的糖無(wú)法分離。

圖1 混合糖磷酸緩沖體系分離圖譜Fig.1 Seperation of sugars in phosphate buffer

緩沖體系 pH改變實(shí)驗(yàn)中,直到 pH達(dá)到 12.46,混合糖溶液B中的各種糖才得到完全分離,圖譜如圖 3。

圖2 磷酸緩沖體系pH12.31下蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖分離圖譜Fig.2 Seperation of sugars in phosphate buffer(pH12.31)

比較圖 2、圖 3可以看出,適當(dāng)提高 pH值至pH12.46分離效果有所改善,但是其峰對(duì)稱性差等問(wèn)題仍無(wú)法解決,而且分離過(guò)程中電流明顯加大。

圖3 磷酸緩沖體系pH12.46下蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖分離圖譜Fig.3 Seperation of sugars in phosphate buffer(pH12.46)

3.4 離子色譜法結(jié)果

取標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)過(guò) 0.22μ m尼龍濾膜和OnGuard II RP柱(2.5 cc,經(jīng)甲醇和水活化),棄去初始 6 mL后收集1 mL流出液,在NaOH/NaOAc梯度程序直接進(jìn)樣分析。結(jié)果見(jiàn)圖 4。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖Fig.4 The chromatogram of 9kinds of sugar 5mg/L mixed standard solution

離子色譜法結(jié)果表明,在同一根色譜柱 (如CarboPac PA20)、同一個(gè)梯度程序中,可同時(shí)檢測(cè)單糖、二糖等,分離效率高。

4 結(jié) 論

目前對(duì)糖類化合物定性定量的測(cè)定方法,主要有氣相色譜法、液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、離子色譜法等,這些方法在測(cè)定低含量的糖類化合物時(shí),除離子色譜法外,需對(duì)樣品進(jìn)行柱前衍生或柱后衍生,操作步驟繁瑣,所需時(shí)間較長(zhǎng),人力和物力成本較高。氣相色譜法是測(cè)單糖的較好方法,但二糖不好氣化不好測(cè)。高效液相色譜法定量上有優(yōu)勢(shì),進(jìn)樣量能控制,但分離效果不理想。毛細(xì)管電泳法具靈敏度高、選擇性好、分離效率高等特點(diǎn),但需對(duì)樣品進(jìn)行柱前衍生。而離子色譜法使用了脈沖安培檢測(cè)器,這種檢測(cè)器可對(duì)糖類化合物直接進(jìn)行檢測(cè),無(wú)需衍生,可直接進(jìn)樣,樣品處理方法非常簡(jiǎn)單,安培檢測(cè)法具有非常高的靈敏度,且具有選擇性,可同時(shí)檢測(cè)多種糖,在測(cè)定中,同時(shí)分離了鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、纖維二糖、麥芽糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸,幾種糖之間的分離度均大于1.5,實(shí)現(xiàn)了基線分離,本方法對(duì)于糖的檢測(cè)限可低至pmol水平。故毛細(xì)管電泳法、離子色譜法可用于稻稈木質(zhì)纖維素水解液中糖組分的分離測(cè)定。

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