趙天湖,范嘉龍,閆 冬,徐人杰,郎昌野,孫 怡,曾曉雄

(南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

大葉冬青苦丁茶是我國民間傳統(tǒng)的“代用茶”品種,系由大葉冬青(Ilex latif olia Thunb)葉加工而成。據(jù)報道,大葉冬青苦丁茶富含多酚類、萜類、氨基酸、皂苷和多糖等生物活性成分,具有清熱解毒、殺菌消炎、健胃消積、止咳化痰、生津止渴、提神醒腦、明目益智和抗輻射、抗衰老、活血脈、調(diào)節(jié)血脂等功效[1～3]。以往對苦丁茶生物活性成分的研究主要集中在三萜類化合物、皂苷類化合物、多酚化合物以及揮發(fā)性成分的分析等方面[4～8]。近幾年來,Sun、何玲玲等對苦丁茶冬青葉多糖的提取、純化、體外抗氧化活性等進行了初步研究[9～13],但未見有關大葉冬青苦丁茶多糖的研究報道。本文采取熱水提取與醇沉制備大葉冬青苦丁茶多糖,利用層析技術對其進行分離純化,并對大葉冬青苦丁茶粗多糖及其純化組分的體外抗氧化活性進行評價,旨在為我國特有藥用植物的深層次開發(fā)利用研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大葉冬青苦丁茶由浙江大學茶學系(浙江杭州)提供。

1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、菲咯嗪、氯化硝基四氮唑藍(NBT)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、還原型輔酶Ⅰ (NADH)、三吡啶吖嗪 (TPTZ),美國 Sigma公司;DEAE-52纖維素,Whatman公司;鄰二氮菲、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、過氧化氫、硫酸亞鐵、氯化鐵、氯化亞鐵、苯酚、濃硫酸、氯化鈉、無水乙醇、氫氧化鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

AY-120電子精密天平,日本 Shimadzu公司;Heidolph Laborota 4000真空旋轉蒸發(fā)儀,德國Heidolph;722可見分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司;Alpha1-2型冷凍干燥機,英國 LABCONCO公司;HL-2B數(shù)顯恒流泵、BS-100A自動部份收集器,上海滬西分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 多糖提取

大葉冬青苦丁茶多糖的提取參照何玲玲等[10]報道的方法并稍作改動。將大葉冬青苦丁茶磨碎,過 80目篩。稱取一定量大葉冬青苦丁茶粉樣,用 15倍體積的85%乙醇80℃回流提取2次,每次1h,以除去大部分脂類和多酚類物質。殘渣用20倍體積的去離子水進行熱提取 3次,水浴溫度 90℃,每次提取時間3 h。提取液離心,合并3次上清液,置旋轉蒸發(fā)儀 50℃減壓濃縮至初始體積的1/4,再用 S-8大孔樹脂脫色[14]。脫色液用sevage法脫蛋白3次,加3倍體積無水乙醇攪拌,過夜,離心,沉淀物經(jīng)干燥后即為大葉冬青苦丁茶粗多糖(粗ILPS)。

1.2.2 粗多糖的純化

粗 ILPS用水溶解,溶液上DEAE-52離子交換柱,并用去離子水、0.1、0.3和 0.5 mol/L NaCl溶液依次梯度洗脫,流速 1.0 mL/min,分步收集 (10 min/管),每梯度20管。用苯酚-硫酸法檢測洗脫液中多糖的含量。根據(jù)洗脫曲線的主峰位合并收集液,50℃旋轉蒸發(fā)濃縮,去離子水透析 48 h以去除NaCl及小分子雜質,最后將透析液冷凍干燥,得大葉冬青苦丁茶純化多糖(ILPS-1,ILPS-2,ILPS-3和 ILPS-4)。

1.2.3 體外抗氧化活性的測定

(1)清除DPPH·自由基活性測定。DPPH·清除能力測定參考文獻[15]的方法。取不同濃度的多糖樣品溶液 1.0 mL于試管中,分別加入 0.3 mL DPPH·溶液(無水乙醇配制,0.4 mmol/L),再加入 2.0 m L水?；靹蚍磻w系,30 min后于分光光度計517 nm處測定吸光值。以水代替樣品溶液、無水乙醇代替DPPH·溶液,作空白實驗調(diào)零用。清除效果依下面公式計算:

其中:A0為對照實驗(水代替樣品溶液)的吸光值;A1為樣品實驗的吸光值;A2為樣品干擾實驗(無水乙醇代替DPPH·溶液)的吸光值。

其中:A0為對照實驗(水代替樣品溶液)的吸光值;A1為樣品實驗的吸光值;A2為樣品干擾實驗(0.1 M pH7.4磷酸鹽緩沖液代替NBT溶液)的吸光值。

(3)清除羥基自由基(·OH)活性測定?？喽〔瓒嗵菍ΑH的清除能力測定參考文獻 [11]的方法,并作適當修改。在反應體系中分別加入 1 mL鄰二氮菲(5 mmol/L),2 mL PBS緩沖液 (0.2 mol/L,pH7.4),充分混勻后,加入 1 mL FeSO4溶液(7.5 mmol/L),立即混勻,再向反應體系中加入不同濃度的多糖溶液 1 m L,混勻。另設陰性對照管和正常管,不加多糖溶液。再分別加入 1 mL0.01%的 H2O2溶液,正常管不加H2O2溶液,以等體積蒸餾水補充體積。在37℃水浴中反應30 min,測定 A536。清除能力依下面公式計算:

其中:A0正常管吸光值:1 mL鄰二氮菲+2 mL PBS+1 mL FeSO4+2 mL H2O;A1陰性對照管吸光值:1 mL鄰二氮菲+2 mL PBS+1 mL FeSO4+1 mL H2O+1 mL H2O2;A2樣品管吸光值:1 mL鄰二氮菲+2 mL PBS+1 mL FeSO4+1 mL樣品溶液+1 mL H2O2。

(4)螯合金屬離子能力測定。大葉冬青苦丁茶粗多糖及其純化組分螯合金屬離子能力的測定參照Yang等[17]的方法進行。取不同濃度的多糖溶液 1.0 m L于試管中,分別加入 0.05 mL氯化亞鐵溶液(2.0 mmol/L)、0.2 mL菲咯嗪溶液(5.0 mmol/L)和 2.25 m L水。混勻反應體系,10 min后于分光光度計562 nm處測吸光值。以水代替多糖溶液和氯化亞鐵溶液,作空白實驗調(diào)零用。螯合能力依下面公式計算:

其中:A0為對照實驗(水代替多糖溶液)的吸光值;A1為樣品實驗的吸光值;A2為樣品干擾實驗(水代替氯化亞鐵溶液)的吸光值。

(5)總還原力測定。采用鐵還原 /抗氧化能力(Ferric reducing/antioxidant power,FRAP)分析法[18]測定大葉冬青苦丁茶粗多糖及其純化組分的總還原能力。

FeSO4標準曲線的繪制:依次取一系列濃度FeSO4溶液 1.0 mL于不同試管中,再分別加入 5.0 m L FRAP試劑。混勻反應體系,37℃水浴 10 min,于分光光度計593 nm處測吸光值。以FeSO4的濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制 FeSO4標準曲線。

樣品抗氧化活性的測定:配制適當濃度的多糖溶液,取多糖溶液1.0 mL,加FRAP試劑5.0 mL。混勻反應體系,37℃水浴 10 min,于分光光度計 593 nm處測吸光值 A1。以水代替多糖樣液,作空白實驗調(diào)零用。以水代替 FeCl3溶液作為樣品干擾管,測量 A2。

抗氧化能力的 FRAP值以每毫克樣品達到同樣吸光度(A1-A2)所需 FeSO4的摩爾數(shù)表示。

2 結果與分析

2.1 大葉冬青苦丁茶多糖的提取與純化

30 g大葉冬青苦丁茶樣經(jīng)提取后,得到粗 ILPS 1.877 g,得率為 6.26%。

利用 DEAE-52層析柱對大葉冬青苦丁茶粗多糖進行分離,結果見圖 1。從圖中可以看出,粗 ILPS經(jīng)DEAE-52層析柱分離后得到 4個主要組分,分別是水洗脫的組分 ILPS-1,0.1 mol/L NaCl溶液洗脫的組分 ILPS-2,0.3 mol/L NaCl溶液洗脫的組分 ILPS-3和 0.5 mol/L NaCl溶液洗脫的組分 ILPS-4。

圖1 大葉冬青苦丁茶粗多糖經(jīng)DEAE-52色譜柱的梯度洗脫曲線Fig.1 Stepwise elution curve of crude ILPS on DEAE-52chromatography column

2.2 粗ILPS及其純化組分的體外抗氧化活性

2.2.1 大葉冬青苦丁茶多糖清除DPPH·自由基活性

DPPH·自由基是一種較穩(wěn)定的自由基,已被廣泛應用于抗氧化劑清除自由基活性的評價中[19]。圖2反映的是大葉冬青苦丁茶多糖及其純化組分清除DPPH·自由基的活性。從圖中可以看出,在試驗濃度范圍內(nèi),大葉冬青苦丁茶多糖具有一定的清除 DPPH·自由基的能力,其清除活性與多糖濃度呈正相關。其中粗ILPS,ILPS-1,ILPS-2具有較強的清除DPPH·自由基能力;ILPS-3和 ILPS-4在試驗濃度范圍內(nèi)清除能力相對較弱。在質量濃度為 1 000μ g/mL時,粗 ILPS,ILPS-1,ILPS-2,ILPS-3與 ILPS-4對DPPH·自由基的清除率依次為80.21%,65.28%,59.03%,37.50%與4.67%。

圖2 大葉冬青苦丁茶粗多糖及其純化組分清除DPPH·自由基活性Fig.2 The scavenging activities of crude ILPS and its purified fractions on DPPH·free radical

圖3 大葉冬青苦丁茶粗多糖及其純化組分清除活性Fig.3 Scavenging activity of crude ILPS and its purified fractions on

2.2.3 大葉冬青苦丁茶多糖清除羥自由基(·OH)活性

鄰二氮菲-Fe2+氧化還原指示劑的顏色變化可敏銳地反映溶液氧化還原狀態(tài)的改變,通過 Fenton反應產(chǎn)生的·OH是一種強氧化劑,鄰二氮菲與·OH相互作用并產(chǎn)生有色物質,該物質在 536 nm下有最大吸收[21]。·OH在體內(nèi)可以造成細胞損傷,從而會引起許多病理變化,故·OH清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標。

大葉冬青苦丁茶多糖對·OH的清除作用見圖4。

圖4 大葉冬青苦丁茶粗多糖及其純化組分清除·OH活性Fig.4 Scavenging activity of crude ILPS and its purified fractions on hydroxyl radicals

從圖4可以看出,苦丁茶多糖對·OH具有一定的清除作用,且隨著多糖濃度的增加,清除率上升。在質量濃度為 4 000μ g/mL時,粗 ILPS,ILPS-1,ILPS-2,ILPS-3和 ILPS-4的清除率分別為 78.86%,60.04%,60.27%,9.42%和0.64%。同陽性對照物Vc相比,粗ILPS在4 000μ g/mL時清除率與其接近,說明粗ILPS具有較強的清除·OH的能力。

2.2.4 大葉冬青苦丁茶多糖螯合金屬離子能力

在體內(nèi),過渡金屬離子起催化脂質過氧化過程的作用,從而導致多種疾病。在過渡金屬離子中,Fe2+因其具有高的反應活性被認為是最重要的脂質過氧化促進劑。因此,對金屬離子Fe2+的螯合能力被認為是評價藥品抗氧化能力的方法之一。

圖5反映的是大葉冬青苦丁茶粗多糖及其純化組分螯合Fe2+的能力。從圖中可以看出,Fe2+能夠被大葉冬青苦丁茶多糖以劑量依賴方式所螯合。在0～2 000 μ g/mL質量濃度范圍內(nèi),大葉冬青苦丁茶多糖表現(xiàn)出較好的螯合金屬離子的能力,其螯合能力的大小順序依次是 ILPS-4>粗 ILPS>ILPS-1>ILPS-2>ILPS-3。大葉冬青苦丁茶粗多糖及其純化組分在低濃度范圍內(nèi),螯合金屬離子能力隨濃度變化較明顯,而在高濃度范圍內(nèi)變化較平穩(wěn)。在質量濃度為2 000μ g/mL時,粗ILPS,ILPS-1,ILPS-2,ILPS-3和 ILPS-4的螯合率分別為66.15%,46.70%,11.27%,4.71%和76.29%。

圖5 大葉冬青苦丁茶粗多糖及其純化組分螯合金屬離子能力Fig.5 Metal ion chelating activities of crude ILPS and its purified fractions

2.2.5 大葉冬青苦丁茶多糖的總還原力

大葉冬青苦丁茶中的抗氧化物質,可將 Fe3+-T PT Z復合物還原成深藍色的 Fe2+-TPTZ復合物,該藍色復合物在593 nm處有最大吸收值。因此可根據(jù)吸光值的大小計算樣品抗氧化活性的強弱[18]。

本研究中,FRAP值(以每mg樣品達到同樣吸光度所需 FeSO4的mol數(shù)表示)被用來評價大葉冬青苦丁茶多糖(粗 ILPS,ILPS-1,ILPS-2,ILPS-3和 ILPS-4)的抗氧化能力。FRAP值越高,表明抗氧化物質還原的Fe2+越多,即抗氧化物質的抗氧化活性越強。FRAP法的FeSO4標準曲線線性回歸方程為 y=0.0036x+0.0530,回歸系數(shù) R2= 1.0000。粗 ILPS,ILPS-1,ILPS-2,ILPS-3和 ILPS-4的 FRAP值分別是 307.5,47.2,37.5,11.8和 41.4 mol/mg,即大葉冬青苦丁茶多糖對 FRAP的總抗氧化活性順序為粗 ILPS>ILPS-1>ILPS-4>ILPS-2>ILPS-3。

3 結論與討論

大葉冬青苦丁茶粗多糖及其純化多糖組分對DPPH·,和·OH都有一定的清除作用,具有較強的還原能力與螯合金屬離子能力。從實驗結果中可以看出 ,在 DPPH·,和·OH清除能力與總還原力測定中,大葉冬青苦丁茶粗多糖的抗氧化活性明顯高于純化組分的活性。這可能是由于分離純化等操作去除了與多糖結合的成分,如蛋白、多酚等,而這些成分的存在可能會提高樣品的抗氧化活性,同時多種多糖的相互作用也有可能提高其抗氧化活性,具體機理有待于進一步的研究。在螯合金屬離子能力測定中,ILPS-4的螯合金屬離子能力高于粗 ILPS與其它純化組分,并且其具有較強的清除的能力。因此,大葉冬青苦丁茶多糖的結構與其抗氧化能力的關系有待于進一步的研究。

綜上所述,大葉冬青苦丁茶多糖具有較強的體外抗氧化活性,大葉冬青苦丁茶多糖應是大葉冬青苦丁茶的主要功能成分。系統(tǒng)地研究其生物活性有利于有效、全面利用大葉冬青苦丁茶資源。

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